解淀粉芽孢杆菌LJ02对黄瓜抗灰霉病菌的生防效果及其诱导抗性机理的初步研究

 为了解生防解淀粉芽孢杆菌LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的防治效果和作用机制,分别测量了LJ02的发酵上清液和菌体悬浮液的诱导持效期、最适使用浓度以及最佳施用方法,并采用荧光定量PCR的方法法测定了LJ02诱导处理后黄瓜根部和叶部组织中分别表达PR1a蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶的抗性基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-9的相对表达量。结果表明,LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的持效期在7 d左右,且原液与100倍稀释液效果最好,灌根施用效果最佳。LJ02发酵上清液可诱导PR-1、PR-3、PR-9的表达,LJ02菌体悬浮液可诱导PR-1、PR-2、PR-3的表达。     

甲基营养型芽胞杆菌G-1抗菌肽的分离及抑菌作用研究

为探索甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus G-1抑制番茄灰霉病菌的作用机制，采用HPLC、LC-MS等对其分泌的抗菌肽进行分离鉴定，通过扫描电镜观测抗菌肽对番茄灰霉病菌菌丝形态影响，借助RNA-seq研究抗菌肽处理番茄灰霉病菌3、5 d后的差异表达基因。研究结果表明：甲基营养型芽胞杆菌G-1产生的抗菌肽主要为伊枯草菌素A。经菌株G-1抗菌肽处理后，番茄灰霉病菌菌丝生长异常，菌体畸形肿胀，内溶物外渗。基因差异表达分析表明，有40个基因在2个时期均差异表达。GO、KEGG富集分析发现，与萜烯合酶、氨基酸跨膜转运相关的15个基因在各时期均上调表达，与细胞表面受体信号通路、氧化还原酶、果胶裂解酶、单加氧酶等有关的25个基因在各时期均下调表达，其中编码琥珀脱氢酶（SDH）的Bcin02g06840基因及编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的Bcin04g04450基因表达量显著下调。经qRT-PCR验证，8个差异表达基因的表达模式变化与转录组测序分析结果一致。研究表明菌株G-1抗菌肽可能通过抑制番茄灰霉病菌细胞膜组分中SDH、HMGR的合成抑制菌丝及孢子的生长。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63诱抗粗蛋白对黄瓜的诱抗作用

玫瑰黄链霉菌Strempomyces roseoflavus Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗链霉菌,该菌株及其代谢产物对多种重要的植物病原菌都具有较强的抑制作用,为了探明该生防菌产生的诱抗粗蛋白对黄瓜抗病性的诱导作用,采用离体叶片接种的方法,发现诱抗粗蛋白诱导黄瓜叶片灰霉病发病直径显著小于对照;经组织染色法和紫外分光光度计法测定,发现诱抗粗蛋白可以诱导黄瓜叶片中活性氧（ROS）的积累和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等抗病相关酶活性的显著提高;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定,发现诱抗粗蛋白还可以诱导黄瓜叶片中PR-1a、PR-3、PR-9和NPR1等抗病相关基因表达的上调,试验结果表明Men-myco-93-63产生的诱抗粗蛋白能够诱导黄瓜抗病性的提升。     

水稻和稻瘟病菌互作中的信号传导及防御反应基因诱导表达的研究

 水稻和稻瘟病菌互作是研究植物与病原菌互作的模式体系。本文利用3个水稻抗稻瘟病近等基因品系(CO39、C101LAC和C101A51)和2个特异性菌株(M209和M210)构成不同亲和程度的互作关系,研究了稻瘟病菌对3个水稻信号传导途径关键酶合成基因、5个防御反应病程相关蛋白基因和1个防御反应转录因子调控基因诱导表达的作用。结果表明:稻瘟病菌诱导了各种互作关系中水稻OsLOX、OsAOS和OsPAL酶合成基因的表达,水稻启动了茉莉酸和水杨酸防御反应信号传导途径。在不亲和的互作反应中,稻瘟病菌能不同程度地诱导水稻OsPR1a、OsPR2、OsPR3-1、OsPR3-2和OsPR4基因的表达,从而有效激活了防御反应系统,使水稻植株表现为抗病;而在亲和的互作反应中,多数OsPR基因的表达水平低、时间短或没有表达,水稻植株表现为感病。OsMyb基因在各种互作关系中有不同的诱导表达。说明这些防御相关基因的诱导表达可能与水稻抗稻瘟病性相关。     

解淀粉芽孢杆菌LJ1诱导黄瓜抗白粉病的研究

解淀粉芽孢杆菌LJ1是从土壤中分离得到的一株对黄瓜白粉病具有较好防效的生防细菌。田间试验发现,用LJ1发酵上清100倍稀释液喷施黄瓜幼苗,在施药后14 d时其对黄瓜白粉病的防效可达83.45%。为研究LJ1防治病害的作用机制,用LJ1发酵上清100倍稀释液喷施黄瓜幼苗,测定黄瓜叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等与诱导抗病性相关的酶活性和信号分子水杨酸含量的变化,并检测了苗期根围土壤中真菌的动态。结果显示,经过LJ1发酵液处理后3种酶的活性和水杨酸的含量在不同时间点均有一个骤增的过程,其活性显著高于对照,并且7 d后土壤中的可培养真菌数量急剧减少。说明LJ1发酵液中有诱导黄瓜产生抗病性的物质,并且诱导后分泌的抗性物质对真菌具有广谱性。     

壳聚糖诱导黄瓜幼苗抗灰霉病

为了明确壳聚糖(chitosan,CTS)对黄瓜幼苗抗灰霉病的诱导作用,采用根际注射结合叶面喷洒的方法,测定了灰霉病菌侵染下幼苗植株病情指数、防御酶活性和抗病相关物质含量等生理指标。结果表明:CTS降低了黄瓜幼苗的病情指数,最高幅度达39.4%,提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性,增加了总酚、类黄酮和木质素含量。说明CTS能诱导黄瓜幼苗对灰霉病的抗性,且最佳处理浓度为200mg·L-1。     

灰葡萄孢菌nit突变体的诱导及其在营养体亲和性测定中的应用初探

 从山西运城、临汾、长治、晋中、大同等地保护地黄瓜灰霉病病株上采集、分离的分属于3个不同菌丝融合群的8个灰葡萄孢菌单孢菌株,经氯酸盐诱导处理,共获得了抗氯酸盐的硝酸盐利用缺陷突变体(nit突变体)59株,其中nit1型38株,nit3型10株,nitM型11株。所有nit突变株分别在PDA斜面转管培养3次(21 d)后,除6株恢复成野生菌株外,其余多数nit突变菌株表现稳定。来源于同一野生菌株的不同类型nit突变体间或同一菌丝融合群不同野生菌株的nit突变体间可产生互补反应而形成异核体,其中以nitM型突变株互补性最好,在利用nit突变体测定灰葡萄孢菌营养体亲和性时应作为标准菌株。来源于不同菌丝融合群的nit突变体间不能产生互补反应。     

激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性

 激活蛋白PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离的,能诱导植物产生系统获得抗性的蛋白激发子。为了阐明PeaT1诱导植物提高抗性的分子机制,本文采用RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草悬浮细胞后不同时间PR-1a基因的转录活性,在烟草悬浮细胞中加入20μg/mL的PeaT18h后,PR-1a基因转录活性达到最高;相同浓度的PeaT1处理烟草植株,烟草叶片中酸性PR蛋白表达量升高。激光共聚焦显微镜观察到FITC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合;使用共价交联剂BS³证明¹²⁵I-PeaT1可与烟草细胞质膜上的2个分子结合,而与加热或蛋白酶处理的质膜不能发生交联,说明与PeaT1结合的分子具有蛋白特性,分子量分别为20kDa和30kDa。上述实验结果证明在烟草细胞质膜上存在着激发子PeaT1受体样的结合位点。     

一株具有诱导抗性木霉菌株的筛选及其对黄瓜灰霉病诱导抗性的初步研究

从植物根部土壤中分离到一株能够诱导黄瓜产生系统抗性的木霉Tr-92,通过形态观察和18SrDNA序列分析对其进行了分类学鉴定,并进行了诱导黄瓜产生系统抗性能力的初步研究.结果表明,菌株Tr-92的菌落形态和显微形态与木霉一致,18SrDNA序列与哈茨木霉的相似性为99％,初步鉴定为哈茨木霉.利用该菌株孢子悬浮液对5叶期黄瓜苗进行根部诱导接种,24 h后灰霉病菌挑战接种,对灰霉病的防效达56％,叶片中抗性相关酶过氧化物酶、多酚氧化酶、β-1,3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶的酶活性显著上升.表明该菌在黄瓜根部灌施可以诱导叶部系统抗性相关酶的活性升高,可为植物病害的生物防治提供适宜的菌种资源.     

丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探

为探讨植物源化合物丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的诱导作用,初步研究了丁香酚对接种TMV的烟草叶片中叶绿素和丙二醛(MDA)含量,防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物岐化酶(SOD)活性,以及病程相关蛋白基因 PR-1 、PR-3 、PR-5 表达的影响。结果表明:丁香酚处理可促进叶绿素的合成,减轻烟草体内MDA的积累,提高PAL、POD和SOD的活性,增强 PR-1 、PR-3 、PR-5 基因的表达。表明丁香酚可提高植物的诱导抗病性,进而减轻TMV对烟草的危害。     

枯草芽胞杆菌HMB19198菌株抑菌物质的鉴定及其对番茄灰霉病的防治

 设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和rpoC等看家基因序列比对将菌株HMB19198鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果表明,菌株HMB19198的脂肽提取物对灰霉菌表现较强的抑菌活性,通过色谱分离技术结合质谱分析,证明菌株HMB19198主要产生脂肽类抗生素丰原素(fengycin)和表面活性素surfactin,其中fengycin包含fengycin A(C15-C18)和fengycin C(C19-C20)两种同系物。抑菌活性测定表明,fengycin对灰霉菌表现较强的抑菌活性,显微观察发现,fengycin处理后造成灰霉菌菌丝畸形。通过对菌株HMB19198全基因组序列进行分析,获得fengycin合成酶基因簇,从基因水平证明菌株HMB19198可以产生fengycin。     

添加有机物料的微生物生防制剂对草莓灰霉病的防治

为解决微生物生防制剂在实际应用过程中防效不稳定的问题,本研究通过在不同微生物生防产品中添加有机物料,分析了添加有机物料对草莓灰霉病防治和土壤微生物数目的影响。本试验共设15个处理。微生物生防制剂（BCA）包括枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis（Bs）,木霉菌Trichoderma（Tr）,EM菌（effective microorganisms,EM）,半量枯草芽胞杆菌+木霉菌（1/2BT）,以及无菌剂对照（CK）;有机物料用量（米糠+豆粕粉,RB）设3个水平,分别为不添加,1/2RB（15 g/m²米糠+60 g/m²豆粕粉）和RB（30 g/m²米糠+120 g/m²豆粕粉）。移栽55 d后将各处理组分均匀撒施至根周,随后覆盖地膜并滴灌保湿。结果表明,木霉菌和EM菌能够有效降低灰霉病发病率,有机物添加量一致时,微生物生防制剂的防效规律为EM > Tr > Bs > 1/2BT。木霉菌和EM菌单剂在发病较轻的试验地1中防效为60.00%~68.00%,发病严重的试验地2中防效为16.39%~29.01%。各处理中EM+RB防效最高,最高可达90.00%。添加全量米糠和豆粕粉能够显著提高生防制剂的防效。生防制剂添加有机物料的防效规律为BCA+RB > BCA+1/2RB > BCA,Tr+RB防效比Tr单剂施用提高0.17~1.1倍,EM+RB防效比EM单剂提高0.32~1.84倍。同时土壤微生物的数目随有机物料的增加而增加,1/2RB和RB可使数目分别增长0.43~8.86倍和0.93~32.72倍。以上结果表明,实际生产中施用木霉菌或EM菌能够有效防治草莓灰霉病,添加足量的有机物料可以增加土壤微生物丰度从而提高防治效果。     

Biocontrol activity and primed systemic resistance by compost water extracts against anthracnoses of pepper and cucumber

We investigated direct and indirect effects of compost water extracts (CWEs) from Iljuk-3, Iljuk-7, Shinong-8, and Shinong-9 for the control of anthracnoses caused by Colletotrichum coccodes on pepper and C. orbiculare on cucumber. All tested CWEs significantly (P < 0.05) inhibited in vitro conidial germination and appressorium formation of the fungal pathogens; however, DL-β-amino-n-butyric acid (BABA) failed to inhibit the conidial development of the pathogens. Direct treatments of the CWEs and BABA on pepper and cucumber leaves at 1 and 3 days before or after inoculation significantly (P < 0.05) reduced anthracnose severities; Iljuk-3, Shinong-9, and BABA for pepper and Iljuk-7 for cucumber had more protective activities than curative activities. In addition, root treatment of CWEs suppressed anthracnoses on the plants by the pathogens; however, CWE treatment on lower leaves failed to reduce the diseases on the upper leaves of the plants. The CWE root treatments enhanced not only the expression of the pathogenesis-related (PR) genes CABPR1, CABGLU, CAChi2, CaPR-4, CAPO1, and CaPR-10 in pepper and PR1-1a, PR-2, PR-3, and APOX in cucumber but also the activity of β-1,3-glucanase, chitinase, and peroxidase and the generation of hydrogen peroxide in pepper and cucumber under pathogen-inoculated conditions. However, the CWE treatments failed to induce the plant responses under pathogen-free conditions. These results indicated that the CWEs had direct effects, reducing anthracnoses by C. coccodes on pepper leaves and C. orbiculare on cucumber leaves through protective and curative effects. In addition, CWE root treatments could induce systemic resistance in the primed state against pathogens on plant leaves that enhanced PR gene expression, defense-related enzyme production, and hydrogen peroxide generation rapidly and effectively immediately after pathogen infection. Thus, the CWEs might suppress anthracnoses on leaves of both pepper and cucumber through primed (priming-mediated) systemic resistance.     

香榧根腐病病原菌分离鉴定及绿色药剂筛选

<正>0 引言香榧(Torreya grandis cv. Merrillii)为我国特有的珍稀经济干果与重要木本油料作物^[1],主要分布于浙江省诸暨、绍兴、临安等地^[2],香榧产业发展迅速，已成为当地农业支柱产业和农民增收的主要来源^[3]。近年来，多地香榧林出现根腐病且为害日益严重，成为影响香榧产业可持续发展的重要障碍之一。因此香榧根腐病病原菌鉴定与防治技术研发迫在眉睫。本论文通过组织分离法、单孢培养法获得纯菌种，     

空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片组织结构分析及抗氧化系统的影响

空气湿度对番茄灰霉病的发生有显著性影响。为了探明空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片的过程与机理,本研究以‘金棚14-6’番茄为材料,观察分析了高空气相对湿度(80%～95%)和低空气相对湿度(65%～80%)对灰霉菌侵染番茄叶片表型变化、细胞学差异、形态结构变化、活性氧含量和抗氧化酶的影响。结果表明：高湿接种60 h大量芽管伸长出现在叶片下表皮细胞并分化菌丝,叶肉细胞间隙分布了大量的菌丝并伴随病斑出现,灰霉菌在60 h完成侵染;低湿接种108 h芽管伸长出现在叶片下表皮并分化菌丝,叶肉细胞间隙有少量菌丝分布,没有明显病斑出现。随着灰霉菌的侵染,低湿与高湿相比栅栏组织和海绵组织结构从整齐紧密变为排列疏松的时间滞后;高湿和低湿处理的叶片厚度、栅栏组织和海绵组织厚度均呈先上升后下降的变化趋势,侵染后期低湿处理的叶片组织结构厚度显著高于高湿。随着接菌时间延长,高湿和低湿的活性氧含量和抗氧化酶活性处于相对活跃的调整、适应的变化过程,大致呈先上升后下降趋势,而对照和接菌相比无显著差异,变化趋势维持在基本的振幅上。研究显示灰霉菌发生的环境条件：湿度80%～95%和侵染完成时间60 h,即控制高空气湿度的持...     

ABC转运蛋白BcAtm1参与灰葡萄孢分生孢子萌发及对寄主植物的侵染

 灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)引起的灰霉病可在200多种植物上发生,每年造成全世界高达近千亿美元的损失。Atm1是一种在真核生物中进化保守的线粒体内膜ABC转运蛋白,主要通过向细胞质转运Fe/S簇参与维持细胞的正常生命活动,但Atm1在病原菌致病过程中的作用至今仍不清楚。本研究筛选到一株灰葡萄孢ATM1被T-DNA标记的致病缺陷突变体,并在野生型中对该基因实施了敲除。表型分析发现,突变体ΔBcatm1的分生孢子萌发缓慢且不同步,培养4 h的萌发率只有10%(野生型超过90%),直到12 h,萌发率才接近90%;突变体菌丝生长速度减慢,只能达到野生型水平的67%;菜豆成熟叶片离体接种实验显示,突变体ΔBcatm1基本丧失了致病能力,侵入寄主后只能在接种点附近引发微小的病斑,病斑面积只能达到野生型的10%左右。将完整的BcATM1基因重新导入突变体ΔBcatm1可以完全或部分恢复上述异常表型。本研究结果表明BcATM1是一个关键的致病相关基因,参与了灰葡萄孢分生孢子的萌发、菌丝生长及侵染寄主等过程。     

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。     

水稻条斑病菌hrpD5基因在致病性中的功能分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response,HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。