猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆与原核表达

 根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

猪细小病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank发表的猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)中国株基因序列设计引物,通过PCR方法扩增到了PPV LJL12株NS1全长基因,将其克隆到原核表达载pET30a( )上,成功构建原核表达载体pET30a-NS1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为86 ku,与预期大小相符;Western blot分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性.NS1在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性,可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测.     

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株（PPV-N株）的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列（登录号NC_001718）设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21（DE3）pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

NS1基因主要抗原区的可溶性表达及其Dot-ELISA检测方法的建立

【目的】可溶性表达猪流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原区(NS1′)蛋白,获得具有良好抗原性的NS1′蛋白,并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法,为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础。【方法】以质粒pET28a-NS1为模板,PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1′,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pET-32a(+),构建pET32a-NS1′,经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导表达,纯化NS1′并免疫家兔制备多克隆血清,对其进行SDS-PAGE、Western blotting检测和免疫荧光分析,并以纯化的NS1′作为包被抗原初步建立Dot-ELISA检测方法。【结果】PCR扩增获得了长约250bp的H3N2SIV NS1′片段;成功构建了重组载体pET32a-NS1′;SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,融合蛋白NS1′大小约34ku,该蛋白可溶,能与感染SIV的猪血清特异性反应,并且用纯化蛋白NS1′制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NS1,建立的Dot-ELISA检测方法可鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪。【结论】实现了H3N2SIV NS1′蛋白的可溶性表达,表达产物具有良好的抗原性,以NS1′作为包被抗原,建立了检测NS1抗体的Dot-ELISA方法。     

日本脑炎病毒E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达

根据GenBank公布的日本脑炎病毒 (Japaneseencephalitisvirus ,JEV)SA14 14 2减毒株的核苷酸序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,应用RT PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因 (EⅢ) ,将其连接入pMD18 T载体 ,经测序后克隆入原核表达载体pET 32a (+) ,构建原核表达载体pET EⅢ 。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,JEV EⅢ 基因获得表达 ,经细胞定位分析 ,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达EⅢ 蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 1mmol·L-1,诱导时间为 3h。在大肠杆菌中的最高表达量占菌体总蛋白的 5 4 9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板 ,可以明显地区分JEV阴、阳性血清 ,并且不与猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的阳性血清发生反应。结论 :重组JEVEⅢ 蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。     

枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化

【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

猪繁殖候选基因Lhx8的原核表达及条件优化

以猪卵巢组织的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增猪Lhx8基因完整的开发阅读框,将该基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建了原核重组质粒pET28a(+)-Lhx8。将重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现1条特异的蛋白表达条带,分子量为37 kD左右。通过对IPTG浓度和诱导时间的优化,结果显示融合蛋白的最佳诱导浓度为0.4 mmol/L IPTG,最佳诱导时间为37℃诱导12h。     

猪肺炎支原体脂蛋白LppT的多克隆抗体制备及鉴定

试验构建猪肺炎支原体重组表达质粒pET30a-LppT,通过快速定点突变试剂盒将LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp处的A突变为G,使改造后的LppT基因能在大肠杆菌系统中正确表达,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行了蛋白纯化,纯化的目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫新西兰大白兔制备LppT蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导表达后获得1条特异性蛋白条带,分子质量约为110 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以可溶形式表达于上清中,纯化的蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的LppT多克隆抗体进行Western Blot检测,结果表明制备的LppT多克隆抗体具有较强的特异性。     

Molecular Cloning and Prokaryotic Expression of Non-Structural Protein NS1 Gene of Porcine Parvovirus

Porcine parvovirus (PPV) is one of the major agents causing swine reproductive failure. NS1protein is a non-structural protein of PPV and can be used as a reagent for differentiation of vaccinated ani-mals and infected ones. In present study, a recombinant plasmid pET28a/NS1 was constructed by cloning thecoding sequence for NS1 of PPV into pET28a, a bacterial expression vector. The NS1 protein was expressed inE. coli BL21 (DE3) after induced by IPTG and the recombinant fusion protein was purified with affinity chro-matography. Expression amount of NS1 protein was improved by optimizing the inducing parameters. The re-combinant NS1 protein is reactive to PPV positive sera in Western blot and ELISA test and therefore can beapplicable in differential diagnosis of PPV infections.     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

为研究猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）NS1基因，建立快速、准确诊断猪细小病毒的方法，减少猪细小病毒造成的损失，笔者克隆了含有NS1基因的片段，并且与已登录猪细小病毒的相应序列进行比较，成功构建了原核表达重组质粒PET 30a／NS1，并在E.coli中进行了诱导表达。     

日本脑炎病毒WHe株NS1基因的克隆、测序及表达

以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术,克隆了JEV WHe株的NS1基因,并对其进行了测序和序列分析。构建了pET28b-NS1表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,NS1基因全长1 145 bp,其核酸序列与JEV P3株同源性为99．4％,与SA14和SA14-14-2等27个JEV毒株的核苷酸序列同源性为98％,表明NS1基因的保守性很高;pET28b-NS1表达产物的相对分子质量约为43 ku,大小与预期结果相符。NS1基因克隆表达成功。     

Expression and Activity Analysis of Non-Structural Protein 2 （NS2） of Bombyx mori Densovirus Zhenjiang Strain

The gene of the non-structure protein 2 （NS2） was cloned by PCR from the genome ofBombyx mori densovirus Zhenjiang strain （BmDNV-Z）, inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-NS2 and then expressed in bacteria Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Then, the recombinant protein was purified by Ni-NTA column, renatured and tested for enzyme activities. The purified NS2 protein exhibited a helicase activity unwinding double-stranded DNA substrates into single-strand primers, and higher unwinding activity to polarity substrate. Similarly, the purified NS2 protein possessed an ATPase activity and its enzyme activity was 0.276 μmol gg^-1 h^-1 in this study. The results indicated that the non- structure protein which encoded by the gene of BmDNV-Z NS2 possesses the biological activities of helicase and ATPase, and the helicase prefers to polarity substrates. Based on these results, it is speculated that the gene of BmDNV-Z NS2 plays an important role in the viral DNA replication.     

NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

 用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1'、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1'、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.