禽呼肠孤病毒分子生物学诊断方法研究进展

本文综述了禽呼肠孤病毒分子生物学诊断方法,主要包括核酸探针、RT-PCR方法、套式RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、荧光定量RT-PCR方法和环介导等温扩增方法等6种方法,对禽呼肠孤病毒病的诊断和防控有一定的参考价值。     

一步法RT-PCR快速检测禽呼肠孤病毒方法的建立及应用

根据禽呼肠孤病毒(ARV)P10基因保守序列设计了1对引物,建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对ARV扩增结果为阳性,参照毒株扩增结果均为阴性,对禽呼肠孤病毒检测的灵敏性为10pg总RNA。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强敏感性高、简便和快速,可用于禽呼肠孤病毒病的早期确诊和病毒鉴定。     

一例鹅呼肠孤病毒病的实验室检测

通过对疑似感染鹅呼肠孤病毒的病鹅进行实验室检测,有利于对该病的早期确诊,及时采取防控措施。取有典型病理变化的病鹅肝或脾脏组织,采用RT-PCR检测鹅呼肠孤病毒和禽流感病毒,采用I群禽腺病毒通用型二温式PCR方法检测腺病毒,对呼肠孤病毒阳性者进行病毒扩增片段测序。结果鹅呼肠孤病毒测序结果为阳性。I群禽腺病毒和禽流感病毒检测无特异性条带,为阴性。本病例确诊为鹅新型呼肠孤病毒感染。     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株S4基因序列分析

应用非免疫番鸭胚增殖中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,用LSTRIAZOL提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株S4基因节段cDNA.将S4cDNA克隆到PMDl8-T载体上,并进行了鉴定和核苷酸序列测定.序列分析结果,克隆的S4cDNA共1 124bp,包括非编码区和完整的阅读框架.分子进化系统分析表明该毒株与禽呼肠孤病毒(鸡呼肠孤病毒)的亲缘关系较远,DRV-YB与DRV-89330同缘率为93.3%.     

一步法RT—PCR检测禽呼肠孤病毒方法的建立与应用（摘要）

禽呼肠孤病毒 (ＡＲＶ)是呼肠孤病毒属的成员 ,在临床上主要引起鸡病毒性关节炎 /腱鞘炎、吸收障碍综合症等多种疾病。禽呼肠孤病毒感染导致鸡群的饲料报酬降低、生产能力下降、屠宰废弃率高和引起免疫抑制而造成其它疾病的并发或继发感染 ,使鸡群死亡率升高 ,其危害相当严重。目前 ,对于禽呼肠孤病毒的检测已建立起了常规的病毒分离鉴定、ＥＬＩＳＡ和荧光抗体检测方法 ,近年来 ,我们也建立了ＲＴ ＰＣＲ、半套式ＰＣＲ和核酸探针等技术。本研究的目的是建立一种更加简便的一步法ＲＴ ＰＣＲ检测禽呼肠孤病毒的技术。禽呼肠孤病毒为双链Ｒ…     

禽呼肠孤病毒病疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)是目前严重危害养禽业发展的一种病原微生物,其引起的禽呼肠孤病毒病在全球各地的家禽养殖场广泛流行。近年来,ARV在我国养禽业的感染率呈逐渐上升趋势,给我国养禽业造成了重大的经济损失。安全、高效的疫苗是有效预防禽呼肠孤病毒病的重要手段。文章综述了国内外禽呼肠孤病毒病弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的研究进展,以期为研发有效预防禽呼肠孤病毒病疫苗提供参考。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株L1基因的克隆与序列分析

参考禽呼肠孤病毒S1133株（GenBank）L1基因序列设计3对特异性引物,采用RT-PCR方法对禽呼肠孤病毒内蒙古分离株C-98的L1基因进行了克隆和序列测定。结果表明：获得的C-98 L1基因全长3959 bp,其中包括21 bp的5’非编码区和56 bp的3’非编码区,阅读框位于5’端第22位核苷酸与3’端第3903位核苷酸之间。将C-98株与国内外禽呼肠孤病毒群和哺乳动物呼肠孤病毒群的不同分离株进行序列比较,结果显示：C-98与台湾地区分离株919和美国分离株1733、2408、S1133亲缘关系最近,其核苷酸同源性分别为99.8%、99.7%、99.7%、99.4%;与哺乳动物呼肠孤病毒L3基因核苷酸及其编码的氨基酸同源性较低,为43%～45%。     

禽呼肠孤病毒病疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是目前严重危害养禽业发展的一种病原微生物,其引起的禽呼肠孤病毒病在全球各地的家禽养殖场广泛流行.近年来,ARV在我国养禽业的感染率呈逐渐上升趋势,给我国养禽业造成了重大的经济损失.安全、高效的疫苗是有效预防禽呼肠孤病毒病的重要手段.文章综述了国内外禽呼肠孤病毒病弱毒疫...     

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

番鸭呼肠孤病毒非结构基因的克隆和序列分析

参考GenBank禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒(Muscovy Duck Reovirus,MDRV)非结构基因(NS)序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行酶切鉴定和测序;番鸭呼肠孤病毒NS基因由1 291 bp核苷酸组成,与禽呼肠孤病毒NS基因相比,在非编码区第1155位少一个碱基,本文第一次证实1291bp是番鸭呼肠孤病毒NS基因特有的长度;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因的5'末端和3'末端分别为5‘GCTTTT和TCATC-3',是禽类呼肠孤病毒基因末端特有的碱基序列,S14和C4株NS基因的的有效阅读框(24～1127bp)编码367个氨基酸组成的蛋白,分子量约为40kDa;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS蛋白等电点分别是7.3和7.0,GC含量分别为54.26%和53.71%,番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因间核苷酸同源性为99.3%,仅有4个氨基酸差异,S14和C4与法国番鸭呼肠孤病毒89026株NS基因核苷酸同源性分别为87.8%和87.9%,与鸡关节炎病毒S1133 NS基因同源性分别为79.0%和79.3%;进化树分析表明本研究中的两株番鸭呼肠孤病毒非结构基因(NS)与番鸭呼肠孤病毒的亲缘关系比禽呼肠孤病毒近的多,建议番鸭呼肠孤病毒应归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒独立基因群.     

新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测方法建立与初步应用

为建立一种能够快速检测新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的方法,本研究参考GenBank上登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物.经条件优化后,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.对其特异性、敏感性和重复性进行检验.结果显示：该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符,长度为298 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到83.4 pg病毒RNA;而其它病毒：番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒等样品的扩增结果均为阴性.采用该方法对在广东不同地区采集的15份鸭病料样品进行检测,NDRV阳性率为53.33％.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查.     

一种新鹅病——鹅出血性坏死性肝炎

本病的病源为呼肠孤病毒科、正呼肠病毒属、禽呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒。禽呼肠孤病毒已对鸡、火鸡、番鸭、鹅、半番鸭、蛋鸭、肉鸭等禽类致病。除了引起死亡外,总体生产性能低下,大大降低了禽类的经济价值,是值得引起高度重视的禽类病毒性传染病,是新出现的一种鹅病毒性传染病,它将极大危害养鹅业健康发展。     

禽呼肠孤病毒研究进展

禽呼肠孤病毒（Avianreovirus,ARV）属于呼肠孤病毒科,呼肠孤病毒属的成员,是一种能引起关节炎、心包炎、肠炎、肝炎、法氏囊及胸腺萎缩、骨骼异常、产蛋下降和营养吸收障碍等疾病的双链RNA病毒。1957年Olson等首次分离到禽呼肠孤病毒,此后英国、美国、     

禽呼肠孤病毒的分子特征和复制周期

<正>禽呼肠孤病毒是Orthoreovirus属5种病毒之一,该属还包括非致融哺乳动物呼肠孤病毒、致融哺乳动物呼肠孤病毒和狒狒呼肠孤,以及从爬行动物中分离的致融病毒。禽呼肠孤病毒和哺乳动物呼肠孤病毒是Orthoreovirus属的两个主要类群,尽管它们有许多共同的分子特征和物理化学特征,但它们在宿主范围、致病性和基因组编码能力以及各种生物学和血清学特性方面有所不同。     

鹅出血性坏死性肝炎

该病的病原为呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，禽呼肠孤病毒，鹅呼肠孤病毒。禽呼肠孤病毒已对鸡、火鸡，番鸭，鹅、半番鸭、蛋鸭、肉鸭等禽类致病。除了引起死亡外，总体生产性能低下，大大降低了禽类的经济价值，是值得引起高度重视的禽类病毒性传染病，是新出现的一种鹅病毒性传染病，它将极大危害养鹅业健康发展。     

鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析

从患运动障碍的雏鹅肝脏和脾脏分离到一株鹅源呼肠孤病毒,该病毒经琼脂扩试验可与番鸭呼肠孤病毒(MuscovyDuckReovirus,MDRV)的抗血清发生交叉反应,推测其为呼肠孤病毒,命名为GRV1。参考GenBank禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒小外壳蛋白(minorcoreprotein)σC蛋白基因序列设计合成了一对引物,病毒RNA经RT-PCR扩增,产物为810bp,与预期的目的片断大小一致,测序结果表明σC基因在280～1089区间是一个开放性阅读框架,编码269个氨基酸的蛋白,GC含量为49.88%,等电点为6.497,分子量为29.4Ku。核苷酸序列经DNAStar(6.0)软件分析,与法国番鸭呼肠孤病毒89026株核苷酸同源率为93.0%,与鸡呼肠孤病毒σC基因同源率仅为21%～25%,同源性分析表明鹅呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤病毒可能来自同一祖先,建议将鹅呼肠孤病毒连同番鸭呼肠孤病毒归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒的独立基因群。由蛋白质分析软件Anthepro5.0和MultiCoil软件分析表明,抗原区多位于N末端,没有跨膜区,σC为三股螺旋结构,这是我国第一次在鹅体内分离到呼肠孤病毒,同时也是第一次在数据库中提供σC的序列。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达

应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

应用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因的研究

根据离呼肠孤病毒S1133毒株S1基因序列，设计合成XZ11、XZ12和XZ11、XZ33两对引物，用半套式PCR对6株禽呼肠孤病毒标准毒株的核酸进行了检测。结果6株ARV均可扩增出和预期大小相符392bp的PCR产物，而对其他6种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性；该半套式PCR比RT-PCR更加敏感，这种方法可以检测出Ifg的ARV RNA模板。     

番鸭呼肠孤病毒MW97106C蛋白基因克隆及其在E．coli中表达

应用RT～PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因，序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp．编码269个氨基酸，相对分子量为29．4ku，DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93％的同源性，而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21％～25％之间，表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中．经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，Western—blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应．表明σC基因表达产物具有免疫原性，为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。