鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中鹅细小病毒(GPV)的7株全基因序列,在相对保守的NS区域设计了一对引物,以GPV-98E株鹅胚尿囊液的核酸提取物为模板,经优化反应条件,建立了特异性检测GPV的PCR方法。敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4.194 pg,尿囊液的最小检出量为3.09个ELD50;特异性试验结果显示,采用该方法检测GPV能够扩增出与预期大小相符的476 bp的特异性片段,而对作为对照的鸭瘟病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)、鹅副粘病毒(GPMV)的核酸均未扩增出任何条带。在临床检测中,对52份雏鹅的心、肝、肠等组织进行PCR扩增,能够检测到相应的特异性病毒核酸片段,表明建立的鹅细小病毒PCR检测方法具有敏感性高、特异性强的特点,具有潜在的临床应用价值。     

鹅细小病毒PCR诊断方法的初步建立

根据GeneBank上已发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计合成1对引物,以GPV阳性毒株鹅胚尿囊液及攻毒后死亡的雏鹅组织,提取DNA并进行PCR,结果产物扩增出的片段与预期片段440 bp大小相符,测定序列与GeneBank上GPV B株同源性达99%。试验结果显示用该方法可以特异性地诊断出GPV,比琼脂扩散试验(AGP)敏感性高,可检测最低浓度为102.5GELD50/0.2mL;检测攻毒后死亡的雏鹅组织,在脑、肝、肺、肾、肠等组织中均有GPV的存在,可以用于临床可疑病毒的分离鉴定。所建立的PCR方法具有高度的特异性、敏感性和可重复性。     

应用套式PCR在MDCK细胞系中发现犬细小病毒

本研究自１９９７年至１９９９年从国内部分大学实验室、卫生防疫站和动检局陆续收集１１个犬肾（ＭＤＣＫ）细胞系样品,选取犬细小病毒基因组的ＶＰ２基因上４段核苷酸序列作引物,对样品ＤＮＡ进行套式ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）检测;ＰＣＲ扩增产物经０．０１ｇ／ｍＬ琼脂糖凝胶电泳和克隆到ｐＧＥＭ＾－Ｔ载体并进行核苷酸序列测序鉴定后,发现我国ＭＤＣＫ细胞系中存在犬细小病毒的传代病毒株。该病毒基因组部分序列测定结果显示与犬细小病毒ＣＰＶ－Ｎ株有９１％同源性。     

鹅细小病毒与番鸭细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的基因序列,针对两种病毒非结构蛋白(NS)和VP1基因序列的相同区段,分别设计两对引物GPV U·L-1和MDPV U·L-1,以GPV-GZ1株的鹅胚尿囊液和MDPV的番鸭胚尿囊液提取核酸作为模板,分别建立了检测GPV和MDPV的PCR方法.特异性试验结果显示,引物GPV U·L-1仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株分子长为622 bp核酸片段,引物MDPV U·L-1仅特异性扩增出MDPV分子长为624 bp核酸片段,而对DPV、GPMV的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,建立的PCR方法能检测到0.144 Pg的GPV核酸和28.8 pg的MDPV核酸.结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于GPV或MDPV临床感染病例的鉴别诊断.     

犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus,CBo V)的PCR检测方法,了解其流行情况。[方法]根据Gen Bank数据库上CBo V的VP2基因序列合成1对引物,建立PCR检测方法,并运用该方法对临床样品进行检测。[结果]特异性试验中,除CBo V有目的条带出现外,犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬传染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、猫瘟热(FDV)等均无条带出现。敏感性试验表明,此检测方法对CBo V的最低检测量为4.806 2 pg/μL。重复性试验表明,多次重复试验结果一致,表明此方法重复性好。425份样品中仅有1份样品扩增出目的条带,经测序比对鉴定为CBo V。初步的流行病学调查结果表明,CBo V在犬中的流行率与感染率极低。[结论]建立的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可重复性强等特点。     

犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立一种犬瘟热病毒(CDV) RT-nested PCR检测方法.[方法]根据CDV弱毒株Onderstepoort 的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验.[结果]特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带.敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者.重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同.用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT- nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品.[结论]建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查.     

犬细小病毒研究进展

犬细小病毒是自主复制型病毒的一个成员，主要引起狗的肠炎和心肌炎，整个基因组是单链线形的5323个核苷酸，有2个主要的开放阅读框架。     

鹅细小病毒vp3基因PCR检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank上发表的鹅细小病毒B株基因序列,针对vp3基因设计并合成了一对特异性引物,建立GPV vp3基因的PCR诊断方法。结果表明,该方法扩增的产物与预期大小相符(约654bp),而其他相关病毒均为阴性反应,敏感度为12.4pg。对15份GPV疑似病例检出的阳性率为100%,而琼脂扩散试验(AGP)检出的阳性率为60%。证明建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于临床病料的快速诊断。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

犬细小病毒病的PCR临床诊断研究

建立犬细小病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法,并应用于临床诊断.根据犬细小病毒基因保守序列设计一对特异性引物,扩增目的片段大小为448bp.用此引物扩增疫苗中的犬细小病毒和37份病料中的犬细小病毒,并与胶体金诊断试剂盒相对比.实验结果显示:该方法能从疫苗中和临床病料中扩增出犬细小病毒目的基因片段,与胶体金诊断试剂盒相比能克服免疫血清学诊断中的非特异性反应,具有快速、准确、灵敏度高的优点,完全适用于犬细小病毒病的临床诊断.     

牛双芽巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

[目的与方法]根据Genbank上登陆的双芽巴贝斯虫HSP20基因设计两对引物, SHSP-P1与SHSP-P2和SHSP-P3与 SHSP-P4,以其建立牛双芽巴贝斯虫巢式PCR快速检测方法.[结果]第一次、第二次扩增的退火温度均为57℃,分别扩增出约631和409 bp的条带,与预期的大小相符,而作为对照样本的牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现.将感染双芽巴贝斯虫的全血基因组DNA做10倍递减稀释到106倍扩增时,巢式PCR还能见到目的条带,其灵敏度相当于4.6 pg/mL全血基因组DNA.在对50份疫区牛全血DNA样本检测中,阳性检出率分别为22; (11/50).[结论]所建立的牛双芽巴贝斯虫巢式PCR方法准确、敏感、特异,可以用于牛双芽巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义.     

犬瘟热与犬细小病毒病混合感染的治疗探析

犬瘟热(CD)与犬细小病毒病(CP)单独发生率较高,治疗效果也很好。但是目前细小病毒病与犬瘟热混合感染的疾病发生率呈上升趋势,且死亡率很高,给宠物犬造成严重的威胁。笔者针对一例犬的混合感染病例,提出了相应的治疗方案和预防措施。     

犬细小病毒病分子生物学诊断研究进展

就近年发展起来的犬细小病毒病的分子生物学诊断技术作一阐述。     

犬瘟热与犬细小病毒病的组织病理学比较研究

采用大体解剖、石蜡切片、HE染色法对患有犬瘟热及犬细小病毒病而死的6只幼犬的大脑、心、肝、肺、脾、肾、小肠、大肠、肠系膜淋巴结等分别进行组织学观察,结果表明:犬瘟热的主要发病部位在肺;犬细小病毒病的主要发病部位在肠道;这2种病犬的心、肝、肾等均发生颗粒变性、炎性细胞浸润,有充血、出血等症状,脾脏和淋巴结均出现淋巴小结变小,淋巴细胞减少等免疫抑制现象。由此推断:犬瘟热与犬细小病毒在进入机体时损害机体主要部位不同,临床表现症状也稍有差异。     

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

菏泽市区犬6的流行病学调查

为了获得菏泽地区导致犬细小病毒病发病的主要因素,利用准确性高、成本低、耗时少、临床上易于操作的诊断方法,通过对菏泽市3家宠物医院的88例门诊病例作为研究对象,利用临床诊断、血常规分析仪来进行血常规检查和犬细小病毒病的试剂盒CPV抗原检查试纸进行检测来确诊犬细小病毒病的发病情况.结果表明,犬细小病毒病的发病与年龄、时间、季节、免疫状况等方面的因素有密切的关系,为临床实践提供了理论依据.     

犬细小病毒病血象及肝功能的检测

文章就检测天津地区细小病毒病犬血象及血清中丙氨酸氨基转移酶与天冬氨酸氨基转移酶的含量,根据实验采取了30只患病犬的血液,做白细胞计数及分类计数,并用高速离心机（3000r／min）提取血清,使用半自动生化分析仪,测得血清中的ALT与AST的含量。结果表明：30只发病犬白细胞总数下降至（3．45～5．57）×10^9／L,个别犬甚至降到0．45×10^9／L。检测发现嗜中性白细胞数量明显下降,有大量异型淋巴细胞出现,淋巴细胞数量相对增加;测得患病犬血清中的ALT与AST的含量平均值分别为38．74和23．10,均在正常范围内。该检测为天津地区患病犬的临床诊断提供了有价值的材料。     

犬感染犬瘟热病毒后抗体的产生规律及检测方法

由犬瘟热病毒引起的犬瘟热(Canine distemper,CD)疾病,是造成犬及部分食肉目动物的一种具有高度传染性和高死亡率的疾病。犬瘟热病毒感染犬产生抗体的规律在临床上具有非常重要的意义。幼犬在出生后约35 d就失去了母源抗体的保护,需要人工对其进行预防免疫,以获得针对该病毒的特异性抗体。犬瘟热病毒在进入机体后,引起以胸腺依赖性的B2细胞所介导的体液免疫为主,初次免疫应答产生的Ig M稍多于Ig G,再次免疫应答时记忆性B细胞发挥着主要的作用,在很短时间内使得特异性Ig G抗体达到较高水平,且在机体内维持很久的时间。通过掌握Ig M和Ig G抗体产生的量及变化规律,可以诊断疾病发生的过程,为疾病的治疗和预防提供诊断依据。     

犬细小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析

[目的]为分离犬细小病毒（CPV）.[方法]采集疑似CPV感染病死犬的组织病料,用胎猫肾细胞（F81）进行病毒分离,并对分离的病毒进行回归动物试验、间接免疫荧光（IFA）及VP2基因PCR扩增鉴定.[结果]经盲传3代后FS1出现明显细胞病变（CPE）,分离病毒可导致2～3月龄犬出现典型犬细小病毒病（CP）的临床症状和特征性病理变化,通过IFA观察到特异性的绿色荧光,PCR扩增到VP2基因全长为1 755 bp,编码584个氨基酸.它与国内外具有代表性的18株CPVVP2基因的核苷酸同源性为98.0％ ～ 99.8％,氨基酸同源性为96.1％ ～99.8％.[结论]用F81细胞成功分离到1株强毒CPV,命名为YBYJ株.