FPV 4b核心蛋白基因的克隆及其探针制备

利用PCR方法成功克隆了FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段。序列分析表明:该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列同源性为99.5%,只有7个碱基差异(第215位C→A,第386位T→A,第388位G→A,第1 014位T→G,第1 034位T→G,第1 137位C→T,第1 143位A→G)。回收FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒pMD18-T-4b,用EcoRⅠ酶切pMD18-T-4b后得到1个约360 bp大小的DNA片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100 mg/L。敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10 pg。特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

DELLA蛋白的研究进展

在已发现的植物赤霉素(GA)信号传递分子中,有一类N端具有高度保守的DELLA结构域,称为DELLA家族蛋白。介绍了DELLA蛋白的保守域结构、上游基因及降解。     

水稻病程相关蛋白基因OsPR-4b启动子的克隆及缺失体构建

用一对根据已克隆的水稻OsPR-4b基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR-4b基因上游2257 bp的启动子序列.用PLACE软件分析顺式作用元件,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等.将OsPR-4b基因启动子区域及其5'部分缺失构件与gus报道基因相连,并克隆进pCAMBIA1391z载体中,用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR-4b基因表达中的功能.     

核桃GAI基因的克隆和序列分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。利用RT-PCR技术以香玲核桃叶片为试材,克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。对基因和编码蛋白序列进行分析,结果表明,JrGAI基因开放阅读框(ORF)为1 837 bp,编码612个氨基酸;生物信息学分析表明,JrGAI编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域;利用BLASTx和DNAMAN软件进行相似性分析发现JrGAI编码蛋白氨基酸序列与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与辽宁2号核桃同源性最高,达到99%。核桃JrGAI基因的克隆为其进一步研究应用奠定了基础。     

石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约350bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的石蒜全长cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析对阳性克隆进行测序分析验证,克隆了石蒜中1个Cab基因全长cDNA,命名为LrCab(GenBank 登记号:GU362887).LrCab长为1073 bp,从第50 bp开始至847bp含有1个开放阅读框和1个终止密码子,编码 265个氨基酸.LrCab编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5.14和28 010.00 u.通过比较分析,LrCab DNA序列(GU362887)和编码的氨基酸序列与其他种属的Cab基因编码氨基酸序列相似性很高,表明Cab家族基因在进化过程中保守性高.     

棉花SBP家族基因的鉴定与分析

为研究棉花Squamosa启动子结合蛋白(SBP)家族成员的结构和功能,利用生物信息学方法,从棉花全基因组数据库中筛选并鉴定出83个棉花SBP家族成员,命名为GhSBP1—GhSBP83。并对该家族成员的蛋白质理化性质、多序列比对、系统进化树、基因染色体分布、基因结构、基因表达模式进行了全面分析。结果表明,棉花SBP转录因子家族可以分为8个亚族。棉花SBP基因分布在1—8号染色体以及11—13号染色体上。对NCBI中陆地棉的EST数据库进行比对分析,结果显示,40个棉花SBP转录因子家族成员在棉花的分生组织、茎、花、花芽、花药以及棉纤维中广泛表达。其中,GhSBP2、GhSBP4、GhSBP6等20多个基因在花药和棉纤维中均有表达,推测花药和棉纤维的生长发育可能同时受这些基因的控制。     

棉花P-typeATPases基因的克隆及表达分析

为了探明棉花P-type ATPases基因在植物不同组织和多种逆境条件下的表达情况,利用棉花黄萎病菌的P-type ATPases蛋白序列,在GenBank中搜索棉花EST序列,得到2个同源的棉花EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长度为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的同源性达86％左右,将其命名为Gbpatp.洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上.RT-PCR技术检测组织表达特异性分析表明,P-type ATPases在茎和棉絮中的表达量较高,在种子中低水平表达,在叶片和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花较成熟的器官茎、棉絮和种子的生长发育密切相关.在逆境胁迫中发现,干旱处理后Gbpatp的表达强烈,并且随处理时间延长表达量逐渐增加;重金属Cu2+处理24h后Gbpatp表达量升高,但48h急剧下降;Gbpatp在低温处理下也有轻微表达.激素诱导后发现,Gbpatp对赤霉素和脱落酸均有响应,随胁迫时间延长其表达量仍能维持在一定水平.     

矮牵牛细胞色素b5蛋白编码基因difF的克隆及序列分析

以紫红色、蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)的花瓣为材料,提取总RNA,用Oligo(dT)作为引物反转录合成cDNA第一链:以此为模板,用Genebank上的矮牵牛细胞色素b5蛋白DIF-F(difF)的mRNA序列设计成的引物进行PCR扩增,扩增到一条约450 bp的片段,将此片段克隆到pGM-T载体上.对重组克隆进行序列分析,结果表明所克隆到的矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA的编码区含有450个核苷酸,编码149个氨基酸残基;其核苷酸及氨基酸的序列与Genebank上的同源性分别达到99.93;和100;.     

棉花粉蚧化学感受蛋白基因的鉴定与进化分析

昆虫化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)广泛存在于各种昆虫中,与昆虫识别外界信息密切有关.从棉花粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)转录组数据中分析、获得12条化学感受蛋白基因,分别命名为PsolCSP1-PsolCSP12.这些基因与已报道的其他昆虫CSPs基因序列相似性较高,与双翅目、鳞翅目、膜翅目及半翅目昆虫的化学感受蛋白相似性都在10％～50％之间,说明CSPs序列在物种之间高度保守.研究结果为进一步研究棉花粉蚧CSPs的分子结构和功能奠定了基础.     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

陆地棉GhbHLH4基因的克隆与功能分析

bHLH是一类存在于真核生物中的转录因子家族,其成员广泛参与到植物生长发育及抗逆过程之中。但是,在棉花中有关bHLH基因功能的研究报道不多。以陆地棉为材料分离克隆了GhbHLH4基因并对其功能进行了初步分析。结果表明：GhbHLH4基因启动子中含有大量与抗逆相关的顺式作用元件;转GhbHLH4基因的拟南芥植株与野生型相比叶片宽大、根系发达,转GhbHLH4基因植株能够耐受150 mmol/L NaCl并完成整个生长过程。研究结果为深入了解GhbHLH4基因耐盐的分子机理奠定了基础。     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

陆地棉转录因子基因GhMYB108的克隆及其在抗旱中的作用

【目的】MYB基因家族作为植物中最大的转录因子家族之一,在抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用。克隆陆地棉MYB转录因子基因GhMYB108,并进行表达分析,验证其在干旱胁迫响应中的作用,为进一步研究GhMYB108调控陆地棉耐旱的分子机制奠定基础。【方法】根据干旱转录组数据分析,确定GhMYB108为干旱响应基因;运用聚合酶链式反应（PCR）从陆地棉根系cDNA中扩增目的基因;对GhMYB108进行基因结构特征、预测基因序列信息以及系统进化关系等生物信息学分析;利用Plant Care网站对获得的基因启动子序列进行分析;在不同逆境胁迫条件下,对GhMYB108的表达特性进行qRT-PCR分析;通过亚细胞定位确定GhMYB108蛋白在细胞中的位置;利用酵母试验验证其转录活性;使用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默GhMYB108,并用qRT-PCR检测基因沉默效率。观察沉默株系在干旱处理前后的表型变化,并统计存活率,采用试剂盒测定相关生理生化指标;通过对棉花叶片喷施ABA与氟啶酮试验来分析GhMYB108与ABA的关系。【结果】从陆地棉中克隆了GhMYB108（Gh_A10G1563）,其全长879 bp,编码292个氨基酸,其蛋白质相对分子量为33.288 kD,等电点为6.037,多重序列比对和保守结构域分析,发现GhMYB108含有2个高度保守的MYB结合结构域,属于典型的R2R3型MYB转录因子。不同物种亲缘关系分析发现,GhMYB108与AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2的同源性较高,属于同一亚族,且已有研究发现AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2与干旱或ABA信号通路相关。GhMYB108定位于细胞核,且具有转录激活活性。在干旱和对照植株中,GhMYB108均在根中表达量最高,茎中表达量最低,并且受自然干旱、18% PEG 6000模拟干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫诱导表达。GhMYB108沉默之后,在自然干旱条件下,沉默植株出现临界表型,与对照相比,其萎蔫更严重,且存活率降低,一些生理生化指标也发生显著变化,如叶片失水率加快,丙二醛含量升高,叶片相对含水量和脯氨酸含量减少,过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性降低,且通过DAB与NBT染色发现植物体积累了更多过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂^-）。通过对棉花叶片喷施激素ABA或氟啶酮发现GhMYB108可受ABA信号的正调控。【结论】GhMYB108正调控棉花抗旱性,且受ABA信号的正调控。     

陆地棉GhWDR基因的克隆和功能初步解析

WD40蛋白广泛存在于真核生物,在多种生物过程中发挥着重要作用,棉花中鲜有关于WD40蛋白的研究。本研究从陆地棉TM-1克隆了1个WD40基因GhWDR,并对该基因序列、转录及功能进行了研究。结果表明：GhWDR含有4个典型的WD40-repeat结构域,属于WD40超家族蛋白基因。在棉属中该基因高度保守,并且在葡萄、莲花等古老物种中同源序列相似度也较高,表明该基因功能保守,但其同源基因的功能均未见报导。转录分析表明GhWDR在各组织器官中广泛表达,且在迅速伸长的纤维中高水平转录,说明其可能在棉花生长发育及纤维伸长调控中发挥作用。利用模式植物拟南芥对GhWDR功能进行研究,发现其具有促进开花整合子FT和SOC1表达,加速开花的功能。此外,该基因响应冷胁迫下调表达,且启动子包含ABRE元件,推测GhWDR转录在冷胁迫下受ABA抑制。高温诱导GhWDR的表达,缩短营养生长期,使植物提早进入生殖生长,促进早熟。总之,GhWDR可能参与温度调控路径,促进开花,在棉花适应温度变暖和平衡抗寒与生长过程中发挥作用。     

陆地棉BGLU基因家族成员的全基因组鉴定与表达分析

植物BGLU基因在生物和非生物胁迫防御中起着重要作用,利用生物信息学手段对陆地棉（Gossypium hirsutum） BGLU家族成员进行全基因组鉴定,对序列特征、保守域结构、染色体定位、启动子元件等家族特征进行了分析,并进一步结合转录组数据和qRT-PCR分析了BGLU基因家族的病菌胁迫响应模式。结果表明,共鉴定出53个陆地棉BGLU基因,根据系统发育进化关系分为6个亚族,部分基因在病菌胁迫下特异性表达。荧光定量和转录组测序结果表明,GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34在抗病棉花中的表达水平显著高于感病品种,推测这些基因正向调控棉花黄萎病抗性。上述结果为进一步分析棉花BGLU家族基因的功能以及分子机制提供一定的理论基础。     

陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆及序列差异分析

利用同源克隆法克隆获得有酚陆地棉(Gossypium hirsutum)杜松烯合酶(Delta-cadinene sythase)基因。结果表明,该基因长ORF为1 665 bp,编码551个氨基酸,具有类戊二烯的保守结构域,有酚和低酚陆地棉之间,该基因存在序列差异。     

棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析

【目的】克隆陆地棉抗细胞凋亡新基因GhDAD1,为陆地棉细胞凋亡的分子机制提供依据,为培育不早衰陆地棉品种提供理论基础。【方法】采用RT-PCR以及电子克隆获得陆地棉GhDAD1的基因组序列以及全长cDNA序列并进行生物信息学分析,然后通过荧光原位杂交(FISH)技术进行染色体定位,利用real-timePCR进行表达模式分析,分析6-BA、乙烯、H2O2、SA以及NO对GhDAD1表达量的影响。【结果】棉花GhDAD1编码阅读框全长354bp,包含5个外显子,4个内含子以及232bp的5′非编码区和280bp的3′非编码区。氨基酸序列分析表明,GhDAD1蛋白属于DAD家族,与柑桔、拟南芥GhDAD1蛋白的相似性分别为91%和88%,起始密码子区符合Kozark规则,内含子剪接位点符合GT-AG规则。FISH技术将GhDAD1定位于染色体长臂上。real-time PCR分析表明,陆地棉各组织中均表达该基因,花和种胚等幼嫩组织表达量较高,并且随着衰老的进行,表达量降低。利用6-BA、乙烯、水杨酸、一氧化碳以及双氧水处理中棉所10号,qRT-PCR分析表明,6-BA、水杨酸处理能够延缓衰老,增加GhDAD1的表达量;乙烯能够加速衰老,降低GhDAD1的表达量;H2O2对GhDAD1的表达量的影响不大;而NO不同浓度影响不一样,随着浓度的升高,GhDAD1的表达量先升高后降低【。结论】陆地棉中存在抗细胞凋亡基因(GhDAD1)。     

Genbank��½���ޱ�����б�ǩ(EST)�ͻ��������У�GSS���е�SNP����

陆地棉基因组精细定位需要更加丰富的分子标记,为了阐明单核苷酸多态性(SNP)标记资源开发利用的前景,对GenBank数据库中陆地棉表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)进行分析.下载GenBank数据库中公布的陆地棉EST序列及GSS序列,利用DNAStar软件进行叠连群构建及其候选SNP位点分析.结果表明:陆地棉EST序列307414条及GSS序列242015条,EST序列构建3737个叠连群,序列累计10477241 bp.由4条及以上序列组成的叠连群累计序列长度为3761800 bp,发现候选SNP位点1007258个,叠连群平均出现1个SNP位点最低频率为2.32％.GSS序列共构建1517个叠连群,序列累计1625700 bp,发现SNP位点574296个,叠连群平均出现1个SNP位点最低频率为9.18％.陆地棉的EST和GSS均有频率较高SNP位点,GSS出现SNP频率高于EST序列,开发SNP引物3254对.     

棉花亲环素基因GhCYP2的克隆及实时定量表达分析

[目的]分离棉花中的亲环素基因.亲环素基因是一类多基因蛋白质家族,广泛存在于高等植物各个组织和器官中,参与多种重要的生理生化过程.[方法]以小麦亲环素wCyP3基因蛋白序列(AF262984)为探针序列,在GenBank中与棉花EST序列进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条长912 bp的cDNA序列.[结果]序列分析表明,该cDNA含有一个编码174个氨基酸的开放阅读框,基因的编码产物为亲环素蛋白,将该基因命名为GhCYP2(GenBank登录号:JN032296).采用Clustal X将ChCYP2的氨基酸序列与其他生物亲环素氨基酸序列进行相似性比对,发现与水稻、拟南芥等生物的相似性较高,达到80;以上.利用实时荧光定量PCR技术分析了GhCYP2在棉花各个组织器官中的表达模式,检测结果显示:GhCYP2在棉花叶及18DPA棉纤维中的表达量最高,在根、茎、花、3～15DPA、21～30DPA棉纤维中均有适量表达.[结论]推测GhCYP2可能在棉花纤维伸长至次生壁合成的重叠期发挥着信号传导作用.