中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析

为了探索中间偃麦草SGT1基因在小麦抗病反应中的应用潜力,采用RT-PCR和RACE方法克隆出中间偃麦草SGT1基因,命名为TiSGT1。该基因编码蛋白具有SGT1蛋白典型的功能域结构,与大麦SGT1序列高度同源。通过基因重组技术构建了TiSGT1的高效组成型表达载体,通过基因枪法将该载体转化到小麦品种扬麦12基因组中。对转基因植株PCR、Southern杂交与RT-PCR分析表明,TiSGT1基因可在T0、T1和T2代转基因小麦中遗传和表达。黄矮病、白粉病抗性鉴定结果表明,SGT1的超量表达可以提高小麦对黄矮病、白粉病的抗性,TiSGT1可以作为小麦广谱抗病性改良的潜在基因资源。     

小麦抗病基因类似序列BRG1的分离与功能分析

利用cDNA-AFLP技术筛选到1个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642中特异表达的小麦抗病基因类似序列(BYDV resistance-related gene1, BRG1)的基因片段。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从YW642中分离出BRG1基因全长cDNA序列,获得了一个通读的抗病同源基因cDNA序列,编码由645个氨基酸组成的蛋白质,包含1个NB-ARC保守结构域和3个LRR结构域,该蛋白属于nucleotide-site binding, leucine-rich repeats (NBS-LRR)家族。荧光定量或半定量RT-PCR表达分析表明,BRG1在抗病小麦易位系YW642叶片中优势表达,受BYDV的诱导,BYDV接种后48 h表达量最高,BRG1在感病小麦亲本中8601中表达量始终较低,随BYDV接种时间延长呈轻微的下调趋势;而且外源激素水杨酸(SA)与茉莉酸(JA)处理可上调该基因在YW642中的表达。利用病毒介导的基因沉默技术分析了BRG1基因的功能,结果表明该基因沉默的抗病小麦易位系YW642中BYDV相对含量增加,但未造成抗病性表型显著改变,说明该基因参与抗黄矮病反应,但不是小麦抗黄矮病重要基因。     

小偃麦异代换系抗病基因的鉴定及其SSR分子标记

小偃麦山农87074-557是小麦一长穗偃麦草双体异代换系,它保留了偃麦草的许多优良特性,是小麦抗病育种和遗传改良的基础材料.本文利用接种鉴定法对山农87074-557的抗病性进行鉴定表明:其对白粉病和条锈病均表现免疫,其抗性基因来源于长穗偃麦草,且其白粉病和条锈病抗性均分别受1对显性基因控制.在592对小麦SSR引物中寻找到1个标记Xgwm344120/150与白粉病抗性基因和条锈病抗性基因连锁,推测白粉病抗性基因可能为新基因,条锈病抗性基因可能不同于已定位的抗小麦条锈病基因.     

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。     

抗小麦黄矮病相关蛋白激酶TiDPK1与BYDV外壳蛋白的互作

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)引起的小麦重要病毒病。分离于小麦–中间偃麦草易位系的蛋白激酶编码基因TiDPK1, 是一个抗小麦黄矮病相关基因。本文报道利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术对TiDPK1与BYDV外壳蛋白(coat protein, CP)互作的研究结果。酵母双杂交分析结果表明, TiDPK1能够与BYDV-GAV、-PAV株系的CP互作, 双分子荧光互补分析结果进一步表明, TiDPK1可与BYDV的CP互作、产生双分子荧光互补信号, 说明TiDPK1确可与BYDV CP相互作用, 该结果对了解TiDPK1在小麦抗BYDV反应机制具有一定意义。     

现代生物技术和常规育种相结合选育抗黄矮病春小麦新品种的研究

我院与中国农科院作物所合作,利用含中间偃麦草抗黄矮病（BYDV）基因的二倍体异附加系材料L1,转基因易位系材料8601／L1和常规育种相结合育成两个抗黄矮病春小麦新品种张春19号、张春20号应用于生产,经酶联免疫吸附分析（ELISA）和互补DNA分子探针原位杂交检测（GISH）,高抗本区流行黄矮病GPV株系。其中张春20号品质优良,蛋白质含量15．23％,沉降值40．3mL,面包烘烤品质评分94．9分,属优质专用面包小麦品种。     

小麦种质CH7015中抗白粉病基因的SSR定位

为了明确小麦与八倍体小偃麦远缘杂交培育的小麦新种质CH7015中抗白粉病基因的来源及其在染色体上的具体位置。将CH7015与感病品种台长29杂交,对其F_1、BC_1、F_2群体接种白粉病,进行抗病性鉴定和抗感杂交后代的遗传分析,选取分布于小麦21对染色体上的825对SSR引物,采用群体分离分析法(BSA)对台长29×CH7015的F_2群体进行标记筛选。结果显示,CH7015抗性受1对显性核基因控制,其抗白粉病基因PmCH7015可能来源于中间偃麦草。通过抗感基因池和群体筛选,获得5个连锁标记,分别为:Xwmc657、Xgpw2328、Xwmc68、Xgpw4079和Xgpw7272。其中,Xwmc68和Xgpw4079位于PmCH7015两侧,遗传距离分别为8.2,1.4 cM。中国春缺体-四体和双端体的验证结果将抗病基因定位于小麦4B染色体的短臂上(4BS)。综上所述,由于小麦4BS染色体上尚无有关抗白粉病基因的报道,因此,推测PmCH7015是一个新发现的抗白粉病基因位点,其抗性可能来源于中间偃麦草。     

小麦-偃麦草杂种后代及小麦种质资源对纹枯病的抗性

为鉴定小麦-偃麦草杂种后代以及我国小麦品种和育种中间品系对纹枯病的抗性,并且解析偃麦草染色体与纹枯病抗性的关系,在徐州和南京两个试点,采用田间病圃法对321份普通小麦品种或品系和56份小麦-偃麦草杂种后代材料进行了纹枯病抗性鉴定。在徐州试点没有发现高抗纹枯病的种质,但是有52份材料表现中抗反应型,包括34份普通小麦材料,其中萧农8506-1、小偃81、冀植4001、农大195、徐州8913和京东3066A-3的相对抗病指数高于0.7。在南京试点,全部普通小麦材料都不抗纹枯病,只有5份小麦-偃麦草种质表现中抗反应型。部分小麦-偃麦草种质的病情指数不但显著低于感病对照品种苏麦3号和扬麦158,而且还低于抗病对照品种安农8455和宁麦9号,如小麦-中间偃麦草4Ai#2或4Ai#2S附加系、代换系和易位系材料TA3513、TA3516、TA3517和TA3519及小麦-长穗偃麦草第4部分同源群染色体代换系SS767,说明中间偃麦草4Ai#2染色体和长穗偃麦草4J染色体可能与纹枯病病情指数降低有关。基因组原位杂交分析结果表明,4Ai#2染色体属中间偃麦草的J^s基因组,而长穗偃麦草与纹枯病抗性相关的第4部分同源群染色体属J基因组。虽然纹枯病与眼斑病的发病部位和症状非常相似,但抗眼斑病基因Pch1 (Madsen)和Pch2 (Cappelle-Desprez)对纹枯病无效。     

利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能

小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)侵染引起的小麦重要病害之一。利用cDNA-AFLP分析,筛选出在抗黄矮病小麦易位系YW642中特异表达的长度为292 bp的 cDNA片段,以此片段为启始序列,利用RACE和RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,推导该基因编码1个NBS-LRR蛋白,将其命名为TNBL1。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(virus-inducing gene silencing, VIGS)技术,快速分析TNBL1是否参与小麦抗黄矮病反应。通过PCR添加酶切位点、定向酶切与连接,将TNBL1特异的292bp片段反向整合到BSMV-γ链的多克隆位点上,获得重组载体BSMV-γ: TNBL1as,体外转录BSMV-VIGS载体的3个组分(BSMV-TNBL1as、BSMV-α和BSMV-β),等量混合、摩擦接种到抗黄矮病的小麦易位系YW642幼苗叶片上,使YW642中TNBL1基因沉默,然后接种BYDV病原进行黄矮病抗性鉴定。结果表明,TNBL1基因沉默后的YW642对BYDV敏感、显现感病症状,其体内BYDV含量较未发生基因沉默的YW642中的明显增加,证明TNBL1基因是正向调控小麦抗BYDV反应的1个重要基因。     

小麦抗叶锈病基因Lr24的一个新STS标记

来源于长穗偃麦草的基因Lr24对小麦叶锈病具有很高的抗性, 本研究旨在开发用于Lr24基因分子标记辅助育种的新的分子标记。从定位于小麦3D染色体的22对SSR、EST-SSR引物中筛选出4对揭示TcLr24多态性的引物, 用468株F2抗感群体对这4对引物进一步检测, 得到1个与Lr24共分离的EST-SSR标记Xcwem17。对该标记进行测序, 并设计了STS引物。用该STS引物及已知的Lr24 SCAR引物对试验群体进行验证, 两对引物在该F2群体中均表现共分离, 且Xcwem17可在TcLr24单基因系和已知含Lr24的农家品种泰山1号中可扩增出180 bp单一条带, 感病对照及其余7个近等基因系无扩增。该EST-SSR标记可直接用于分子标记辅助选择。     

有机磷农药降解菌—阴沟肠杆菌的生物学特性

【研究目的】对有机磷农药降解菌阴沟肠杆菌的生物学特性进行研究,为研究其降解特性机理及应用提供理论依据。【方法】测定阴沟肠杆菌生长曲线、生理生化特征,筛选出最适生长培养基,测定不同温度、pH值、摇床振数、装液量下的生长状况,确定最适生长条件,测定对乐果、甲胺磷、敌敌畏、敌百虫的耐受力和利用情况。【结果】阴沟肠杆菌培养3h后进入对数生长期,可以利用分解大部分含碳化合物,在营养贫瘠的条件上生长,生长温度范围为10~43℃,生长pH值范围为6~12,对乐果、甲胺磷、敌敌畏、敌百虫的降解利用必须建立在一定的营养物质的基础上。【结论】该菌的繁殖速度快,在营养条件较贫瘠的条件下就可以生存,是一株生存能力很强的菌株,适合应用于土壤、水体环境中的有机磷农药的降解。     

油菜cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定

核盘菌 [Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary] 是引起油菜菌核病的病原真菌。核盘菌侵染植物细胞早期,可分泌一些细胞壁降解酶, 如不同类型的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)。这些酶对病菌在植物组织上的定植起关键作用, 同时酶活性的高低也决定病原菌的毒性或致病性。PG可以激活细胞的防卫反应而与其酶活性无关。为了解PG的信号转导途径, 利用RT-PCR方法克隆了核盘菌的PG基因, 将PG的编码区与酵母GAL4的DNA结合功能区融合, 构建到酵母诱饵蛋白表达载体PGBKT7中; 然后在酵母中构建了油菜cDNA表达文库。通过酵母双杂交方法在油菜cDNA表达文库中对与PG互作的蛋白进行了筛选, 分离到一个与PG互作的蛋白, 测序及BLAST分析表明该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域, 称为C2结构域(C2-domain), 推测该蛋白是一种钙依赖的膜结合蛋白。该蛋白与拟南芥中一个含C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达80.24%。利用半定量PCR分析了核盘菌诱导后该基因在油菜花、茎、叶中的表达, 结果表明该基因在叶片中表达量最高。克隆到的C2蛋白与其他物种中的C2蛋白比较发现, 与钙离子结合的天冬氨酸残基很保守。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

水稻条纹叶枯病抗性育种研究

利用日本育成的抗条纹叶枯病优质粳稻品种,与江苏高产品种杂交,将其条纹叶枯病抗性导入江苏高产粳稻品种,达到有利基因的聚合,改良现有粳稻品种的条纹叶枯病抗性。结果表明,在充分发病的自然条件下对条纹叶枯病抗性选择的效果十分明显,只要具有一定的选择压,很容易选择到抗性好的株系。关东194是一个优良的条纹叶枯病抗源亲本,在粳稻条纹叶枯病抗性改良和品质改良中值得加以利用。通过连续3年的定向选择,已经获得一批抗条纹叶枯病的优良品种（系）。其中“宁4009”已于2007年1月通过江苏省审定,定名为“南粳44”。     

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害, 通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法, 将抗稻瘟病的Pi9(t)基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中, 经多代大田或/和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选, 获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17~L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系C1~C7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或/和温室抗病性鉴定, 结果显示, 株系L17~L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性, 抗性水平与Pi9(t)基因的供体亲本75-1-127相当, 抗谱相同; 对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似, 不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比, 成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术, 在同一PCR反应中可同时选择Pi9(t)和Xa21基因, 提高了PCR选择效率。     

大穗型小麦品种强、弱势籽粒淀粉积累和相关酶活性的比较

在大田条件下, 以两个大穗型小麦品种山农12和PH01-35为材料, 对籽粒发育过程中强、弱势籽粒淀粉积累及其相关酶活性变化进行了比较研究。结果表明, 两品种强势粒直链淀粉积累量和支链淀粉积累量均高于弱势粒。Logistic方程模拟淀粉积累过程, 强势粒淀粉积累起始势(C₀)高, 活跃持续期长, 平均积累速率(R_mean)高, 最终淀粉积累量高。 籽粒蔗糖合酶(SS)、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、UDPG焦磷酸化酶(UGPase)、可溶性淀粉合酶(SSS)和束缚态淀粉合酶(GBSS)活性均呈单峰曲线变化, 强势粒上述酶活性均高于弱势粒。花后7~21 d, 弱势粒蔗糖含量明显高于强势粒, 表明弱势粒淀粉积累量低, 并不以其淀粉合成底物的供给为限制因子, 而主要与淀粉合成能力低有关, 同时与籽粒灌浆前期胚乳细胞的数量关系密切。     

水分胁迫下一氧化氮对小麦幼苗根系生长和吸收的影响

以25%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱, 利用一氧化氮(nitric oxide, NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP) 处理小麦幼苗, 探讨外源NO对水分胁迫下小麦幼苗根系生长和吸收的影响。结果表明, 50 mol L^-1 SNP可增加小麦主根长度及侧根数目, 分别比对照增加11.94%和83.78%。同时, SNP可使水分胁迫下小麦的根系活力提高55.88%, 根系K⁺ 的含量提高42.52%。膜片钳全细胞电流显示, SNP处理可增强小麦根细胞质膜内向K⁺ 电流, 而NO的专一清除剂c-PTIO可以逆转SNP的上述效应。因此认为, 外源NO可通过提高小麦根系活力, 增强根细胞质膜内向K⁺ 通道的活性, 从而促进根细胞对K⁺ 的吸收以适应水分胁迫。     

不同环境条件下稻米组氨酸和精氨酸的胚乳和母体植株QTL分析

利用汕优63重组自交系与双亲回交产生的BC1F1和BC2F1群体,采用新发展的包括环境互作效应在内的多遗传体系QTL作图方法和基因定位软件,对稻米两种半必需氨基酸（组氨酸和精氨酸）进行三倍体胚乳和二倍体母体植株等不同遗传体系的QTL定位分析。共检测到10个控制组氨酸含量的QTL以及8个控制精氨酸含量的QTL。全部QTL均具有极显著的三倍体胚乳和二倍体母体植株基因的加性主效应,其中4个QTL具有显著或极显著的三倍体胚乳显性主效应,7个QTL还具有明显的环境互作效应。     

亚麻木质素合成途径中关键酶基因片段的克隆与序列分析

亚麻是一种重要的韧皮纤维作物, 木质素对亚麻纤维的性能和品质具有较大影响。以亚麻(Linum usitatissimum L.)茎秆表皮细胞的mRNA为模板, 利用木质素合成途径中关键酶基因的同源基因保守序列设计简并引物, 通过RT-PCR扩增, 电泳获得13个特异带。分别将这些DNA片段连接到T载体后转化大肠杆菌, 从重组质粒转化菌分别挑取5~8个单菌落测定插入片段序列, 得到关键酶基因新的片段序列8个。生物信息学分析结果表明, 这些新片段分别属于3个基因家族。其中, 2个CCoAOMT基因片段(GenBank登录号为EF214740, EF214741), 3个4CL基因片段(GenBank登录号为EF214737, EF214738, EF214739), 3个F5H基因片段(GenBank登录号为EF214745, EF214746, EF214747), 推测亚麻中这几个木质素代谢关键调控酶基因存在多基因家族。新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列和了解调控亚麻木质素的生物合成奠定了基础。