斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。     

AQUAVAC-ESC疫苗免疫预防斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肠道败血症的田间试验

应用AQUAVAC-ESC疫苗在中国广西进行斑点叉尾鮰肠道败血症的免疫预防试验，以评估该疫苗的效能。结果表明，疫苗对鱼苗是安全的。AQUAVAC-ESC灵敏度高，鱼苗阶段就能刺激鱼的免疫系统产生特异性抗体。合理使用AQUAVAC-ESC可以提高饲料转化率，降低生产成本。     

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)化系统形态学和组织学的初步研究

通过对斑点又尾细(Ictalurus punctatus)消化系统的形态学和组织学观察,结果表明,消化道分化为明显的食道、胃、肠、肛门4个部分.食道肌肉层发达;胃黏膜表层为单层柱状细胞.肠由前、中、后3段构成,肠黏膜表面为单层柱状细胞,肠前段粘膜皱褶和杯状细胞丰富,肠后段次之,肠中段最少.肠前段、肠中段和肠后段肌层厚度分别约为(104.87±0.07)μm、(48.60±0.03)μm、(135.29±0.05)μm;肛门肌层发达.消化腺由肝脏、胰腺和胆囊组成,胰腺属弥散型;胆囊由浆膜层、肌层和粘膜层构成.     

斑点叉尾(鱼回)LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

LEAP-2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2) 抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,其生物学活性来自成熟肽区域,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。本文以斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) LEAP-2成熟肽(mLEAP2)为研究对象,拟通过建立毕赤酵母表达系统,实现mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达,以期获得具生物学活性的重组体mLEAP2 (rmLEAP2),为进一步研究其功能和扩大制备奠定基础。首先以既有的斑点叉尾鮰mLEAP2的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板,通过PCR扩增,获得5’端含EcoRⅠ酶切位点、3’端含NotⅠ酶切位点及6×his标签的LEAP-2成熟肽基因mLEAP2,然后将其与真核表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”;电转化至毕赤酵母GS115细胞中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选,获得高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/m条件下,以0.5%的甲醇对其诱导表达120 h;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,通过MALDI-TOF/TOF质谱对纯化产物的结构进行分析和鉴定。结果表明：表达的重组体蛋白为预期的目的蛋白rmLEAP2,其表达量约2.2 mg/L;另一方面,抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。     

AQUAVAC-ESC疫苗免疫预防斑点叉尾(鱼回)(Ictalurus punctatus)肠道败血症的田间试验

应用AQUAVAC-ESC疫苗在中国广西进行斑点叉尾(鱼回)肠道败血症的免疫预防试验,以评估该疫苗的效能.结果表明,疫苗对鱼苗是安全的.AQUAVAC-ESC灵敏度高,鱼苗阶段就能刺激鱼的免疫系统产生特异性抗体.合理使用AQUAVAC-ESC可以提高饲料转化率,降低生产成本.     

斑点叉尾(鮰)血液学指标及血细胞特点分析

拟测定斑点叉尾■的血液生理生化指标及细胞形态。结果表明,细胞形态丰富,包含原红细胞、早幼红细胞、晚幼红细胞、红细胞、原粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血栓细胞、淋巴细胞等,但未检测到嗜碱性粒细胞;谷丙转氨酶活性为(9.60±1.52) U/L,血糖浓度为(0.15±0.08) mmol/L,血清总蛋白浓度为(35.16±5.01) g/L,总胆固醇浓度为(5.37±0.77) mmol/L,白蛋白浓度为(10.92±2.27) g/L,碱性磷酸酶活性为(19.60±4.45) U/L,肌酐浓度为(37.54±2.05)μmol/L,尿素浓度为(1.26±0.20) mmol/L,总胆红素浓度为(25.86±8.77)μmol/L。研究结果可作为斑点叉尾■正常血液生化指标。     

斑点叉尾鮰骨骼系统解剖观察

采用常规煮沸剥离方法分析斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)骨骼系统的组成,得到了斑点叉尾鮰的完整骨骼标本和单个骨骼标本。对标本进行摄影、分析、处理,并总结出相应的骨骼特征。结果表明:斑点叉尾鮰骨骼系统由269块骨骼组成,其中脑颅区40块、咽颅区79块、附肢骨骼52块、躯干部98块,有鳍棘。     

斑点叉尾鮰常见病害的防治

介绍斑点叉尾鮰常见病害的防治方法,包括出血性败血病、细菌性肠炎病、烂尾病、小瓜虫病、轮虫病、粘孢子虫病、锚头鳋病等,以供养殖户参考。     

敌百虫对斑点叉尾鮰的急性毒性试验

[目的]了解敌百虫对斑点叉尾鮰的急性毒性情况。[方法]以健康斑点叉尾鮰鱼种为试材,平均体重46.7 g,敌百虫设6个浓度梯度(0.1、0.4、0.8、1.2、2.4和3.2 mg/L),在室内常温静水条件下,对斑点叉尾鮰进行急性毒性正交试验。[结果]敌百虫对斑点叉尾鮰的24、48、72、96 h的半致死浓度分别为1.6、1.1、0.8、0.7 mg/L;安全浓度0.07 mg/L。敌百虫毒性强,使用时必须等毒性消失后才能放鱼苗;不同鱼类对敌百虫敏感性有差异很大,斑点叉尾鮰对敌百虫非常敏感,浓度为0.8 mg/L时已有将近50%的鱼死亡,而未死亡的鱼也表现出不同的中毒症状;大剂量使用不仅会出现残留、阻碍鱼类生长,而且还会污染水质。[结论]建议生产上敌百虫与其他药物轮用,使用时须等毒性消失后使用。     

斑点叉尾鮰病毒疫苗的研制

为了控制斑点叉尾鮰病毒性出血病造成大规模死亡,用离心干燥法研制出斑点叉尾鮰病毒疫苗,通过试验检测,可使斑点叉尾鮰的成活率稳定在80%以上,从而提高斑点叉尾鮰养殖业的经济效益.     

斑点叉尾鮰气单胞菌的分离与鉴定

集约化养殖中,气单胞菌属细菌已成为危害渔业生产的重要致病菌。本研究自患病斑点叉尾鮰体内分离出5株气单胞菌,经形态学观察、生长特性及生理生化反应测试、鉴定,其中AHIA02、AHIA04、AHIA05为嗜水气单胞菌;AHIA01、AHIA03为豚鼠气单胞菌。用20种常规抗生素分别对分离菌株进行药物敏感性试验,结果表明:所有分离菌株仅对奥复星、复方新诺明、先锋必素等3种抗生素敏感,交叉耐药性和多重耐药性现象严重。     

斑点叉尾鮰细菌性病原的分离与鉴定

报道从湖北省宜都市和长阳土家族自治县内清江河内养殖网箱中患病斑点叉尾鮰体内和体表分离致病菌的初步鉴定结果。从患病斑点叉尾鮰上共分离19个菌株,经分别采用注射和浸泡法人工感染试验,证明其中11个菌株能导致试验鱼80%~100%的死亡。根据对菌株的形态和生化特性的测定结果,11个菌株中的BH-001、BH-005、BH-009和BH-011等4个菌株属于叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri),而BH-002、BH-015、BH-017和BH-019等4个菌株属于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。而BH-004、BH-013和BH-016等3个菌株尚未能鉴定其种类。     

湖北宜都斑点叉尾鮰微卫星遗传多样性分析

以湖北省宜都市的斑点叉尾鮰为研究对象,利用8个微卫星位点IpCG0033、IpCG0035、IpCG0040、IpCG0041、IpCG0043、IpCG0051、IpCG0054、IpCG0057的引物进行了遗传分析,统计分析了等位基因数、杂合度、平均多态信息含量等遗传参数,并检测了群体符合Hardy-Weinberg平衡的状况。结果显示:8个微卫星标记位点在群体中共检测到47个等位基因,观测等位基因数在3~8个,平均有效等位基因数为4.254 8个,群体观测杂合度为0.787 3,期望杂合度为0.728 2,平均多态信息含量(PIC)为0.692 0,达到高度多态(PIC>0.5),8个位点中有4个(IpCG0033、IpCG0041、IpCG0054、IpCG0057)处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),另外4个处于不平衡状态(P<0.05)。结果表明我国湖北省宜都市养殖的斑点叉尾鮰目前仍具有较高的遗传多样性,遗传信息丰富,遗传变异大,可以作为良好的育种材料。     

Immunocytochemical Identification and Localization of Diffuse Neuroendocrine System （DNES） Cells in Gastrointestinal Tract of Channel Catfish （Ictalurus punctatus）

To detect distribution and relative frequency of diffuse neuroendocrine system （DNES） cells in the gastrointestinal tract of channel catfish （lctalurus punctatus）, the intestinal tract of channel catfish was divided into seven portions from proximal to distal： the enlarged area after oesophagus, cardia, fundus, pylorus, and anterior, middle, and posterior intestine. Immunohistochemical method using the strept avidin-biotin-complex （SABC） was employed. All antisera between seven portions of the channel catfish were compared statistically using statistical package for the social science （SPSS）. Five types of DNES ceils were determined： neuropeptide Y-immunoreactive （NPY-IR） cells were demonstrated in both anterior and middle intestine; serotonin （5-HT） immunoreactive cells were detected throughout the whole gastrointestinal tract; vasoactive intestinal peptide （VIP） positive cells were at the highest frequency in pylorus; glucagon-immunoreactive （GLU-IR） cells were moderate in number in the fundus and anterior, middle intestine, and no immunoreactivity was determined in the other portions; somatostatin （SOM） positive cells were more abundant in the anterior and middle intestine. The regional distribution and relative frequency of immunoreactive cells in the channel catfish, Ictalurus punctatus, are essentially similar to those of other fish. However, some characteristics are observed in this species, which further proved that the diversity of the physiological function of DNES cells was based on their morphology.     

尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性

Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。     

抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略

抗菌肽抗菌谱广、活性稳定,具有与抗生素不同的抗菌机制,在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性,在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力,能够发展为取代抗生素的新型药剂,在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式,其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展,探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略,并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。     

斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定

[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3～0.5)μm×(5～10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。     

饲料糖水平对斑点叉尾鮰生长和生理机能的影响

为了研究饲料不同糖水平对斑点叉尾鮰幼鱼生长和生理机能的影响,配制投喂6个糖水平(0、8％、16％、24％、32％和40％)的等蛋白、等脂肪试验饲料,经过90 d试验期后发现:(1)随着饲料糖水平的升高,试验鱼的特定生长率、增重率、蛋白质效率呈现出先升高后下降的趋势,饵料系数则呈现出先下降后上升的趋势.(2)饲料糖水平对斑点叉尾鮰肌肉的粗蛋白、粗灰分、水分含量无影响,但对粗脂肪含量有影响,呈现一定的正相关性.(3)血浆葡萄糖浓度、胆固醇含量、甘油三酯含量、总胆汁酸含量等相关血液指标随饲料糖水平变化呈升高的趋势.(4)血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性随摄入饲料糖水平升高而升高,而碱性磷酸酶含量随饲料糖水平的升高呈现先升高后降低的趋势.综合各项研究指标结果认为,在斑点叉尾鮰幼鱼饲料中添加16％～24％的糖含量较为合适.     

饲料糖水平对斑点叉尾鮰生长和生理机能的影响

为了研究饲料不同糖水平对斑点叉尾鮰幼鱼生长和生理机能的影响,配制投喂6 个糖水平（0、8%、16%、24%、32%和40%）的等蛋白、等脂肪试验饲料,经过90 d 试验期后发现：（1）随着饲料糖水平的升高,试验鱼的特定生长率、增重率、蛋白质效率呈现出先升高后下降的趋势,饵料系数则呈现出先下降后上升的趋势。（2）饲料糖水平对斑点叉尾鮰肌肉的粗蛋白、粗灰分、水分含量无影响,但对粗脂肪含量有影响,呈现一定的正相关性。（3）血浆葡萄糖浓度、胆固醇含量、甘油三酯含量、总胆汁酸含量等相关血液指标随饲料糖水平变化呈升高的趋势。（4）血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性随摄入饲料糖水平升高而升高,而碱性磷酸酶含量随饲料糖水平的升高呈现先升高后降低的趋势。综合各项研究指标结果认为,在斑点叉尾鮰幼鱼饲料中添加16%~24%的糖含量较为合适。