早孕小鼠子宫内膜MMP10的表达及其意义

目的:探讨基质金属蛋白酶10(MMP10)基因及其蛋白在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达规律及意义.方法:采用RT-PCR、原位杂交、免疫组化和western-blot法分别检测受孕3～7 d的小鼠子宫内膜MMP10基因和蛋白的表达及分布,并以未孕小鼠子宫内膜为对照.结果:①早孕小鼠子宫内膜组织MMP10基因和蛋白的表达较未孕小鼠均显著增加,且表达量从着床前期到着床后期逐渐增强,其中d6、d7表达最强,与其他妊娠各期比较差异有统计学意义;②MMP10基因和蛋白表达主要分布在子宫内膜间质细胞.结论:MMP10在早孕小鼠子宫内膜组织中高表达可能有利于降解细胞外基质,促进胚胎滋养细胞的侵袭,参与着床中子宫内膜的蜕膜化过程以及胚胎的早期增殖与分化.     

早孕小鼠子宫内膜MMP10的表达及其意义

目的：探讨基质金属蛋白酶10（MMP10）基因及其蛋白在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达规律及意义.方法：采用RT-PCR、原位杂交、免疫组化和Western-blot法分别检测受孕3-7 d的小鼠子宫内膜MMP10基因和蛋白的表达及分布,并以未孕小鼠子宫内膜为对照.结果：①早孕小鼠子宫内膜组织MMP10基因和蛋白的表达较未孕小鼠均显著增加,且表达量从着床前期到着床后期逐渐增强,其中d6、d7表达最强,与其他妊娠各期比较差异有统计学意义;②MMP10基因和蛋白表达主要分布在子宫内膜间质细胞.结论：MMP10在早孕小鼠子宫内膜组织中高表达可能有利于降解细胞外基质,促进胚胎滋养细胞的侵袭,参与着床中子宫内膜的蜕膜化过程以及胚胎的早期增殖与分化.     

白介素1受体ⅡmRNA在小鼠子宫蜕膜中的转录

采用实时定量PCR方法检测白介素1受体Ⅱ基因在小鼠子宫蜕膜组织或细胞中的转录.获取正常的小鼠子宫蜕膜组织和人工诱导蜕膜化组织,同时利用酶消化分离小鼠子宫内膜基质细胞,进行体外诱导蜕膜化,以未诱导的子宫内膜基质细胞为对照.结果表明:白介素1受体Ⅱ在正常子宫蜕膜组织、人工诱导蜕膜化组织、小鼠子宫内膜蜕膜化基质细胞中表达水平均显著高于对照,说明白介素1受体Ⅱ可能参与子宫内膜蜕膜化过程.     

猪USP18基因表达规律及其与产仔数性状 的关联分析

[目的]明确泛素特异性蛋白酶18基因(USP18)在猪不同妊娠时期子宫内膜中的表达规律及其与雌激素和孕激素的关系,并分析其多态性与产仔数性状的关联性,为揭示USP18基因在猪妊娠过程中的作用机理提供参考依据.[方法]PCR扩增猪USP18基因编码区(CDS)序列及开展相关生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测USP18基因在梅山猪和大白猪妊娠15、26和50 d子宫内膜中的表达水平,通过体外细胞试验检测分析雌二醇和孕酮联合处理对子宫内膜上皮细胞USP18基因表达的影响,并采用PCR-RFLP和SPSS 19.0检测猪USP18基因多态性与产仔数性状的关联性.[结果]猪USP18基因CDS序列为966 bp,共编码322个氨基酸残基,编码蛋白分子量为37 kD,理论等电点(pI)为6.74;猪USP18氨基酸序列与牛USP18氨基酸序列的同源性为82%,二者的遗传距离最近.USP18基因在妊娠15和26 d梅山猪和大白猪子宫内膜中的相对表达量均明显高于妊娠50 d,且在妊娠26和50 d,USP18基因在梅山猪子宫内膜组织中的相对表达量显著高于在大白猪子宫内膜组织中的相对表达量(P<0.05,下同).以10-10 mol/L雌二醇和10-8 mol/L孕酮联合处理子宫内膜上皮细胞,USP18基因在子宫内膜上皮细胞中的相对表达量呈上调趋势,且显著高于激素处理前的相对表达量.在猪USP18基因CDS序列953 bp处存在1个SNP位点(T/G错义突变),其不同基因型与产仔数性状的关联分析结果表明,在经产母猪中,TG基因型母猪产活仔数最多,GG基因型母猪产活仔数最少,且差异显著.[结论]猪USP18基因在附植期子宫内膜中高水平表达,且在子宫内膜上皮细胞中的表达受雌激素和孕激素诱导,表明USP18基因在妊娠早期建立过程中发挥着重要作用.USP18基因在梅山猪和大白猪间的差异表达可能是导致梅山猪产仔数高于大白猪的一个重要因素.     

蛋鸡子宫内膜细胞的分离培养与鉴定及性腺激素对其增殖的影响

为探讨蛋鸡子宫内膜细胞的形态学特点、生长规律,本试验采用Ⅰ型胶原酶消化的方法获取蛋鸡子宫内膜上皮细胞和基质细胞,采用免疫组织化学法进行细胞鉴定,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色(MTT)法测得细胞生长曲线,并研究不同浓度水平的性腺激素对子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖的影响。结果显示,该方法培养的上皮细胞和基质细胞分别对角蛋白质ck18单克隆抗体和波形蛋白质抗体呈阳性;蛋鸡子宫内膜上皮细胞和基质细胞在接种后第2 d开始进入对数生长期,第7 d进入平台期;孕酮(100 nmol/L)能显著促进子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖;孕酮(100 nmol/L)和10 nmol/L、100 nmol/L雌激素组合对子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖均有显著促进作用。表明本研究成功培养了蛋鸡子宫内膜上皮细胞和基质细胞,并证实这2种细胞的细胞周期均为7 d,一定浓度的孕酮和雌激素及其组合对子宫内膜上皮细胞和基质细胞的体外增殖均有促进作用。     

下调DKK2表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究RNA干扰Dickkopf-2基因(DKK2)表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响。[方法]设计并合成3条针对DKK2基因的siRNA,在转染试剂LipofectamineTM2000介导下转染小鼠子宫内膜基质细胞,用RT-q PCR法检测转染前、后DKK2基因的表达量,筛选干扰效率最高的1条siRNA。用该siRNA转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h,利用Caspase3活性和Annexin-V FITC/PI双染法检测干扰DKK2基因对细胞凋亡的影响;用CCK8细胞计数法检测该siRNA干扰DKK2基因不同时间对小鼠子宫内膜基质细胞增殖的影响。[结果]3条siRNA均能有效抑制DKK2基因的表达,RT-q PCR结果显示DKK2基因表达水平显著降低(siRNA2,P0.05;siRNA1、siRNA3,P0.01);CCK8法结果显示siRNA干扰DKK2后对小鼠子宫内膜基质细胞有明显的抑制作用(24 h、48 h,P0.05);Caspase3活性检测和Annexin-V FITC/PI双染法结果显示,siRNA1转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h后,Caspase3活性明显增加(P0.01),细胞凋亡率明显增加(P0.01),凋亡率为18.48%。[结论]利用RNA干扰技术沉默DKK2基因的表达可以明显抑制小鼠子宫内膜基质细胞的增殖并促进凋亡。     

C-erbB2蛋白在小鼠围着床期子宫中的表达和定位

为研究C-erbB2蛋白在小鼠围着床期子宫中的蛋白定位,通过免疫组化方法检测C-erbB2蛋白在围者床期小鼠子宫中定位情况.研究结果表明:在未孕子宫和空白对照组子宫中未见C-erbB2蛋白的表达,第1～3 d子宫中C-erbB2蛋白主要分布在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞胞膜上,子宫内膜基质细胞中未见表达,第4～5 d子宫中C-erbB2蛋白除了表达在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞胞膜上,上皮下基质细胞膜上可见弱阳性表达,第6～8 d的子宫中C-erbB2蛋白主要分布在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞以及围绕着床位点的蜕膜细胞胞膜上,各组肌层均未见阳性表达,C-erbB2蛋白在围着床期小鼠子宫组织中的表达呈规律性变化.     

脂肪酸结合蛋白4在小鼠子宫蜕膜中的表达

[目的]检测脂肪酸结合蛋白4(FABP4)在小鼠子宫蜕膜细胞中的表达。[方法]获取正常的小鼠子宫蜕膜组织和人工诱导蜕膜化组织,同时利用酶消化分离小鼠子宫内膜基质细胞,进行体外诱导蜕膜化,利用实时定量PCR检测脂肪酸结合蛋白4在子宫蜕膜组织细胞中的表达。[结果]FABP 4在小鼠正常子宫蜕膜组织、人工诱导蜕膜化组织及子宫内膜蜕膜化基质细胞中的表达水平均显著高于对照组。[结论]FABP4可能参与了小鼠子宫内膜蜕膜化过程,为研究蜕膜化机理奠定了基础。     

早期流产大鼠子宫中IL-18和NF-κB及iNOS的表达

[目的]检测了早期流产、正常妊娠和非妊娠大鼠子宫中白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、核转录因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)及诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的分布与表达,探讨IL-18、iNOS和NF-κB的表达与流产的关系.[方法]采用阴道涂片法将经过自然交配的大鼠分为流产组、正常妊娠组和非妊娠组3组,每组10只.流产组大鼠于妊娠第7天和第8天分别灌服米非司酮4 mg/(kg·d).各实验组大鼠均于交配后第9天处死,取子宫,切片,免疫组织化学SP法染色后进行图像分析.[结果]IL-18、NF-κB和iNOS在正常妊娠组、非妊娠组和流产组大鼠子宫腔上皮细胞、腺上皮细胞、子宫基质细胞或蜕膜细胞、子宫肌层平滑肌细胞及部分血管内皮细胞中均有表达.与正常妊娠组相比,流产组大鼠子宫中IL-18和iNOS的表达极显著减弱(P<0.01),NF-κB表达极显著增强(P<0.01),血管内皮细胞和平滑肌细胞中IL-18、NF-κB和iNOS的表达均极显著增加(P<0.01).[结论]IL-18、NF-KB和iNOS的异常表达可能与流产有关.     

早孕小鼠子宫内膜ICAM-1的表达及意义

探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因及蛋白在早孕小鼠子宫内膜的表达及其意义 方法: 收集妊娠1-5 d的早孕小鼠子宫内膜,利用RT-PCR、免疫组织化和Western-blot方法检测ICAM-1基因及蛋白的表达及分布;着床期小鼠单侧宫角注射ICAM-1单抗,观察胚胎着床变化. 结果: 1. ICAM-1 mRNA孕D1到D3逐渐增高,D4达最高,D5开始降低;2. 子宫内膜上皮细胞,基质细胞,血管上皮细胞均有ICAM-1的表达,阳性细胞数量、表达强度和表达时间呈现一定规律性;3. ICAM-1 D1、D2、D3略有升高,D4有强表达,D5略有下降;4. 单侧宫角注射ICAM-1单抗后,该侧胚胎发生流产. 结论: ICAM-1在早孕小鼠子宫内膜的表达变化及分布,提示ICAM-1参与了胚泡着床,ICAM-1可能起调节子宫内膜的局部免疫作用.     

小鼠胚泡植入不同时期子宫内膜组织细胞蛋白质组研究

利用固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离妊娠第3天(3 d)、第5天(5 d)、第7天(7 d)小鼠子宫内膜的总蛋白质;考马斯亮蓝染色、PDQuest 2DE软件分析获得3个不同孕期的蛋白质表达谱;图像分析以5 d的图谱为参考,3 d、7 d与其匹配率分别为68%、61%.在等电点PI 3～10、分子量14.4 KDa～116.0 KDa范围内分离得3 d、5 d、7 d小鼠子宫内膜蛋白点大约分别为713个、736个、673个.选取差异蛋白质点进行MEDLI-TOF质谱分析.查询数据库,获取有意义的蛋白点,分别为载脂蛋白A-I、膜联蛋白A1、谷光甘肽转移酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、烯醇化酶.研究结果表明,在胚泡植入窗口期(5 d),小鼠子宫内膜合成蛋白质的种类和数量明显增加,以适应胚泡植入.子宫内膜表达的蛋白质在调控子宫基质降解和子宫内膜的局部免疫反应方面中扮演着重要角色.     

内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的影响

研究了内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的数量和分布的影响,以探讨巨噬细胞对胚胎的着床和维持的作用。采用昆明系妊娠小鼠分为对照组和试验组,在小鼠妊娠6 d(D_6)对照组腹腔注射生理盐水,试验组分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,分别注射1、2、4μg剂量的内毒素,用酶组织化学染色的方法显示出子宫内巨噬细胞的数量和分布。结果显示,与对照组相比较,试验Ⅰ、Ⅲ组子宫内巨噬细胞的数量明显增多,差异极显著,而试验Ⅱ组与对照组没有显著差异。巨噬细胞在子宫环肌外层、环肌内层和内膜上的分布与对照组相比较,环肌外层巨噬细胞数量减少,而环肌内层和内膜的巨噬细胞数量明显增多,差异显著。提示内毒素使妊娠小鼠子宫内巨噬细胞数量增多,细胞向子宫内膜迁移,而不利于胚胎着床和维持,可能对母胎免疫耐受产生影响。     

缺氧诱导因子2α在大鼠早期妊娠中的表达与调节

利用原位杂交、免疫组织化学、Western blot以及荧光定量PCR等试验技术,研究HIF-2α基因在大鼠早期妊娠1～9 d、激素处理、人工诱导蜕膜化及体外诱导人子宫基质细胞蜕膜化模型中表达情况。妊娠1～5 d子宫基质细胞中低表达;妊娠第6天在围绕着床位点子宫基质细胞中HIF-2α表达升高;妊娠第7～9天HIF-2α蜕膜中表达逐渐增强;24 h雌激素和孕酮处理HIF-2α在子宫中表达无变化。HIF-2α在人工诱导蜕膜化子宫中高表达。在体外诱导人子宫内膜基质细胞蜕膜化模型中,HIF-2α随诱导天数增加表达升高。体内体外试验结果表明,HIF-2α可能在早期妊娠蜕膜化过程中发挥作用。     

早孕小鼠子宫内膜ICAM-1的表达及意义

探讨细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因及蛋白在早孕小鼠子宫内膜的表达及其意义方法：收集妊娠1-5d的早孕小鼠子宫内膜,利用RT-PCR、免疫组织化和Western-blot方法检测ICAM-1基因及蛋白的表达及分布;着床期小鼠单侧宫角注射ICAM-1单抗,观察胚胎着床变化．结果：1．ICAM-1 mRNA孕D1到D3逐渐增高,D4达最高,D5开始降低;2．子宫内膜上皮细胞,基质细胞,血管上皮细胞均有ICAM-1的表达,阳性细胞数量、表达强度和表达时间呈现一定规律性;3．ICAM-1D1、D2、D3略有升高,D4有强表达,D5略有下降;4．单侧宫角注射ICAM-1单抗后,该侧胚胎发生流产．结论：ICAM-1在早孕小鼠子宫内膜的表达变化及分布,提示ICAM-1参与了胚泡着床,ICAM-1可能起调节子宫内膜的局部免疫作用．     

小鼠胚泡植入不同时期子宫内膜组织细胞蛋白质组研究

利用固相pH梯度双向凝胶电泳（2D-PAGE）分别分离妊娠第3天（3 d）、第5天（5 d）、第7天（7 d）小鼠子宫内膜的总蛋白质;考马斯亮蓝染色、PDQuest 2DE软件分析获得3个不同孕期的蛋白质表达谱;图像分析以5 d的图谱为参考,3 d、7 d与其匹配率分别为68%、61%.在等电点PI 3-10、分子量14.4 KDa-116.0 KDa范围内分离得3 d、5 d、7 d小鼠子宫内膜蛋白点大约分别为713个、736个、673个.选取差异蛋白质点进行MEDLI-TOF质谱分析,查询数据库,获取有意义的蛋白点,分别为载脂蛋白A-I、膜联蛋白A1、谷光甘肽转移酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、烯醇化酶.研究结果表明,在胚泡植入窗口期（5 d）,小鼠子宫内膜合成蛋白质的种类和数量明显增加,以适应胚泡植入.子宫内膜表达的蛋白质在调控子宫基质降解和子宫内膜的局部免疫反应方面中扮演着重要角色.     

山羊子宫内膜基质细胞的分离培养及鉴定

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。     

妊娠、泌乳不同时期小鼠催乳素释放肽mRNA在甲状腺中的表达

为了研究妊娠、泌乳不同时期PrRP mRNA在甲状腺中的表达水平,取36只小鼠,分为妊娠早(6 d)、中(12 d)、晚期(18 d)和泌乳早(6 d)、中(12 d)、晚期(18 d)6组,每组6只,以GAPDH作为内对照探究小鼠甲状腺中PrRP mRNA的相对含量。结果表明,妊娠期和泌乳期PrRP mRNA在甲状腺中的表达均呈现先升高再降低的趋势;妊娠和泌乳的不同时期PrRPmRNA的表达水平不同,对催乳素的释放调节水平不同,PrRP mRNA可能通过调节催乳素的释放来影响泌乳量。     

5-HT及5-HT1A受体在不同妊娠阶段大鼠子宫中的分布

 【目的】研究5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）及5-HT1A受体在SD大鼠妊娠期子宫中的分布情况和变化规律。【方法】选取均为正常妊娠的30 只雌性SD大鼠分为妊娠3 d、妊娠5 d、妊娠7 d、妊娠13 d、妊娠19 d及产后第1天6组,处死各组大鼠,取子宫制作石蜡切片,经免疫组织化学SP 法染色后,进行观察分析。【结果】5-HT及5-HT1A受体免疫阳性产物广泛存在于子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞、血管内皮细胞、基质细胞、蜕膜细胞、免疫细胞及肌纤维中;5-HT在妊娠7 d和妊娠13 d着色最深,5-HT1A受体在妊娠13 d着色最深。5-HT及5-HT1A受体免疫阳性产物相对表达量的T检验表明,子宫内膜5-HT在妊娠7 d和妊娠13 d的表达较妊娠3 d、妊娠5 d和产后极显著的增加（P＜0.01）,较妊娠19 d显著增加（P＜0.05）;子宫肌层5-HT在妊娠19 d的表达较妊娠7 d显著减少（P＜0.05）,较妊娠13 d极显著的减少（P＜0.01）。子宫内膜5-HT1A受体在妊娠13 d较妊娠3 d、妊娠5 d、妊娠19 d及产后极显著的增加（P＜0.01）,较妊娠7 d显著增加（P＜0.05）;子宫肌层5-HT1A受体在妊娠13 d较妊娠各个时期极显著增加（P＜0.01）。5-HT和5-HT1A受体在妊娠期子宫中的表达,具有极显著的正相关性。【结论】5-HT和5-HT1A受体在妊娠期子宫中的表达具有一定规律,5-HT通过5-HT1A受体参与妊娠的调节。     

护卵汤对多周期促排卵小鼠子宫内膜ER/PR蛋白表达的影响

目的 观察中药护卵汤对反复多周期促排卵小鼠子宫内膜容受性的干预作用,为中医药辅治体外受精-胚胎移植（IVF-ET）提供更多的实验依据。方法 建立反复多周期促排卵小鼠模型（模型组）,部分给予中药护卵汤治疗（中药组）,以及未使用药物的自然周期小鼠为正常对照（空白组）。比较各组在孕2 d、孕5 d两个时间段的子宫形态及雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的蛋白表达。结果 子宫内膜光学形态：与空白组和中药组相比,孕5 d模型组小鼠子宫内膜发育明显不良。子宫内膜ER蛋白表达：与模型组相比,孕2 d和孕5 d中药组小鼠子宫内膜ER蛋白表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与空白组相比,孕5 d中药组小鼠子宫内膜ER蛋白表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。子宫内膜PR蛋白表达：孕2 d和孕5 d中药组小鼠子宫内膜PR蛋白表达均较模型组和空白组明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 在西医多周期促排卵过程中辅以中药护卵汤,能促进子宫内膜生长发育,增加子宫内膜ER/PR蛋白表达,改善多周期促排卵小鼠的子宫内膜容受性。     

CD58对山羊子宫内膜γδT细胞活化及其分泌TGF-βs的作用

用MTT法测定了CD58对山羊妊娠不同时期子宫内膜γδT细胞的活化作用,同时应用ELISA法,分别测定了山羊妊娠第30天的子宫局部γδT细胞在体外活化后分泌TGF-βs的特性。结果表明,CD58可以剂量依赖的方式刺激γδT细胞活化,在试验剂量范围内,1.25mg/LCD58刺激作用最强。同时,各刺激因素的作用在妊娠的不同时期也存在差异,在相同剂量CD58的刺激下,γδT细胞的活化程度自妊娠第20天起至妊娠3个月,依次升高,4个月又呈下降趋势。PHA-P和CD58均可刺激子宫内膜γδT细胞分泌TGF-β1和TGF-β2,其分泌量与细胞的活化程度一致。与目前已研究的小鼠等动物不同,TGF-β1的分泌量显著高于TGF-β2。