基于PCR-DGGE技术分析生物絮团的细菌群落结构

在草鱼养殖过程中添加碳源(葡萄糖)维持水体C∶N为20∶1以培养生物絮团,通过对生物絮团细菌群落构成进行种类鉴定来评价生物絮团中功能微生物的组成.采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术分析生物絮团形成第5、10和15天的细菌群落结构.DGGE指纹图谱结果分析表明:第5天和第10天的相似性最高,达67.4％;第5天和第15天相似性系数最低仅为40.5％.第10天时微生物多样性最高,第15天时多样性最低.对DGGE指纹图谱特征条带进行回收、克隆测序,结果表明,生物絮团培养过程主要微生物类群隶属于以下6个纲:α-变形菌纲( Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲( Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(B acteroidetes),其中α-、β-及γ-变形菌占据主要位置.α-proteobacteria为3个阶段的共有优势菌,第5天时特异菌包括食酸菌属(Acidovorax)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium),第10天和15天分别为芽孢杆菌属(Bacillus)与红球菌属(Rhodococcus).研究首次发现,生物絮团应用于淡水养殖系统时细菌的组成和多样性都极其丰富,通过结合分析这些微生物的功能特点,为生物絮团技术在实际养殖生产中的进一步应用奠定基础.     

一株芽孢杆菌的分离鉴定及在生物絮团对虾养殖中的应用

从对虾养殖池中分离到1株细菌(编号2013042402,简称菌株02),分别用16S rDNA序列比对法和细菌全细胞脂肪酸气相色谱法对该菌进行鉴定.结果显示,菌株02为芽孢杆菌(Bacillus sp.).为探讨该芽孢杆菌在生物絮团对虾养殖中的使用效果,实验分别设置加菌加糖组(菌株02的量为2.0× 104 CFU/ml,蔗糖量为饵料的70％)、加菌组、加糖组(生物絮团组)及空白对照组,研究了菌株02对养殖水质(温度、盐度、溶氧、pH、氨氮及亚硝酸氮)、对虾存活率及水体中主要菌群组成等指标的影响.结果显示,加菌加糖组能显著降低养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮浓度,提高对虾存活率.生物絮团对虾养殖系统中添加菌株02,能够改善菌群结构,抑制弧菌生长.研究结果可为生物絮团对虾养殖中定向培养有益微生物提供技术支持.     

漠斑牙鲆仔鱼、稚鱼和幼鱼对低盐度的耐受力和淡水驯化技术的研究

研究了漠斑牙鲆仔鱼、稚鱼和幼鱼对低盐度的耐受力和漠斑牙鲆的淡水驯化技术。初孵仔鱼在盐度为5的水中最多存活5d,5d以后全部死亡。30日龄稚鱼在4h10min淡水组全部死亡,对淡水的耐受力较低,而盐度为5～25的各组72h的存活率都在95.00%以上。90日龄幼鱼经缓慢淡水驯化9d后存活率可达98%以上,对漠斑牙鲆幼鱼进行淡水驯化的最佳年龄为90日龄。淡水驯化影响幼鱼初期的摄食,以后则逐渐趋于正常;急性淡水驯化对幼鱼的伤害比缓慢淡水驯化大;漠斑牙鲆对低盐的耐受力随生长和发育逐渐增加,年龄是影响幼鱼对低盐度耐受力的主要因素。     

生物絮凝技术处理水产养殖用水效果的初步研究

在水产养殖中应用生物絮凝技术(BFT),可以将养殖过程中产生的残饵和粪便转化为可被部分养殖对象重新摄食的絮体饵料,而且在絮凝体形成过程中对水体氨氮等物质的去除有明显作用。试验在自建的生物絮凝反应器中分别接种活性污泥和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),研究絮凝体形成过程中主要水质指标的变化情况。结果表明:接种活性污泥的装置中,氨氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为72.25%、94.04%;接种枯草芽孢杆菌的装置中,氨氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为81.53%、97.89%;同时接种活性污泥和枯草芽孢杆菌的装置中,氨氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为40.85%、63.19%;对照装置中不接种任何物质,氨氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为11.41%、70.56%。分别接种活性污泥和枯草芽孢杆菌的装置在去除氨氮、亚硝酸盐氮方面较好。试验装置中所形成的絮体颗粒直径在0.1~1.0 mm,粒径大小适合作为部分养殖鱼类稚鱼期的开口饵料。     

硝化型生物絮团的驯化培养

为培养硝化型生物絮团、减少碳源投加、提高絮团效率并缩短培养周期,文章采用养殖废水排污口底泥为接种污泥培养生物絮团,通过逐渐减少碳源投加,开展了硝化型生物絮团的定向培养,并结合高通量测序分析了生物絮团菌群变化。结果显示,排污口底泥主要优势菌群与其他报道的异养生物絮团一致,具有良好的微生物菌群基础,能够在7 d内形成出水稳定的生物絮团。随着碳源减少,生物絮团微生物菌群结构随之改变,32 d后形成硝化型生物絮团。高通量测序结果显示,接种污泥和硝化型生物絮团主要优势菌群均为变形菌门和拟杆菌门。在纲水平上,原始污泥优势菌群为Gammaproteobacteria (γ-变形杆菌属)、Bacteroidia (拟杆菌属)和Deltaproteobacteria (δ-变形杆菌属),而硝化型生物絮团优势菌群为Bacteroidia、Gammaproteobacteria和Anaerolineae (厌氧绳菌属)。硝化型生物絮团硝化菌总相对丰度对比原始污泥有了较大提高,出水水质稳定,能有效调控养殖后期水质并降低养殖成本。     

碱度对水产养殖絮体生物学特性及氨氮转化的影响

在异位式生物絮凝反应器中,添加鳗鲡循环水养殖系统中收集的残饵粪便进行生物絮体培养,用碳酸氢钠和1mol/L HCl控制反应器中的碱度水平(以CaCO3计)为:a组≥250mg/L、b组150~200mg/L、c组75~100mg/L,研究碱度对絮体形成过程中3种形态氮含量、絮体的氮素转化及粗蛋白、粗脂肪和胞外聚合物含量的影响,用IlluminaMiseq测序技术检测了絮体微生物群落的多样性。试验结果表明,碱度150~200mg/L试验组絮体氮素转化率[(70.84±7.67)%]、粗蛋白含量[(36.74±0.59)%]、疏松结合胞外聚合物和紧密结合胞外聚合物中蛋白质与多糖比和絮体原核、真核微生物群落Shannon多样性指数均优于其他试验组。将碱度提高至逾150mg/L,可促使反应器中的硝化作用。3组絮体中具有显著性差异的原核微生物优势菌群为变形菌门和Saccharibacteria门,3个试验组中变形菌门的比例分别为45.96%、27.81%、80.07%;絮体真核微生物具有显著性差异的优势菌群为子囊菌门和纤毛虫门,3个试验组中纤毛虫门的比例分别为7.24%、0.43%、14.85%。异位式生物絮体培养过程中碱度应控制在150mg/L以上时,絮体微生物多样性增加,氮素转化效率增高。     

微生态制剂-生物膜对虾养殖系统水质净化效果研究

为提高对虾养殖系统水质净化能力,改善对虾养殖水环境,利用3种微生态制剂(枯草芽孢杆菌、硝化细菌、光合细菌)和2种生物膜载体(陶粒、纤维毛球)建立4个南美白对虾(Penaeus vannamei)养殖系统,比较不同养殖系统硝化功能的建立过程及对氨氮和亚硝酸盐氮的净化能力,采用高通量测序方法分析细菌群落结构。结果表明,各系统硝化功能建立后,24 h氨氮去除率较初期分别提高12.47%、13.95%、17.25%和17.65%。以纤维毛球为载体,投加硝化细菌、枯草芽孢杆菌和光合细菌系统的氨氧化能力和亚硝酸盐氧化能力强于陶粒系统,24 h氨氮去除率分别高9.03%和9.06%。投放虾苗后,在30 d养殖周期内,各系统氨氮和亚硝酸盐氮含量分别维持在0.20 mg/L和0.15 mg/L以下,硝酸盐氮含量呈缓慢上升趋势。细菌群落结构分析表明,养殖系统生物膜中优势菌门均为变形菌门,占比超40%;优势菌纲为α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲,系统中存在Nitrosomonas、Nitrospira和Nitrococcus等多种参与水体净化以及Algisphaera、Gemmatimonas和Paucibacter等参与有机质分解与对虾益生作用的类群。本研究可为减少养殖水体废物排放及降低水生环境污染风险提供参考。     

生物絮团中异养亚硝化菌的分离鉴定及其特性

采用富集培养、分离纯化等微生物学手段,从对虾养殖池的生物絮团中筛选出两株对氨氮具有高转化率的菌株.16S rRNA测序及系统发育分析结果表明,两株菌均属于盐单胞菌属,菌株2011072708与食物盐单胞菌Halomonas alimentaria有99％的同源性,而菌株2011072709与胜利盐单胞菌H.shengliensis有100％的同源性.比较研究了两株菌在不同温度、盐度、pH、碳氮比条件下对氨氮的转化率,菌株2011072708在温度37℃、盐度30～40、pH 8、碳氮比28的条件下对氨氮的转化率最高;菌株2011072709在温度27～42℃、盐度40～50、pH 6、碳氮比21的条件下对氨氮的转化率最高.研究结果表明,胜利盐单胞菌（2011072709）对温度、盐度、pH、碳氮比等各方面的适应性优于食物盐单胞菌（2011072708）,更适合在生物絮团技术中得到应用.     

不同盐度对生物絮团、对虾生长以及酶活性的影响

在不同盐度条件下进行凡纳滨对虾的生物絮团养殖试验,研究盐度对生物絮团养殖水质和对虾生长及其酶活性的影响。试验设5个盐度梯度(10、15、20、25、30),生物絮团初始量为20 mL/L,对虾密度为500尾/m^3,试验周期30 d。试验结果显示,15盐度组与20盐度组的对虾体质量增长率最大,达70.73%,10盐度组的体质量增长率最小,达50.24%。盐度越高生物絮团生长越快,30盐度组17 d生物絮团沉降量达200 mL/L,之后逐渐降至43 mL/L,其他组呈相同变化趋势。试验过程中水体总碱度与pH持续降低,但不同组间差异不显著(P>0.05)。盐度越高氨氮累积越快,30盐度组在第6 d达到最大质量浓度8.62 mg/L,之后降至0 mg/L,其他组呈相同趋势变化。盐度越低亚硝态氮累积越快,10盐度组在第6 d达到最大质量浓度9.18 mg/L,之后降至0 mg/L,其他组呈相同趋势变化。硝态氮在不同盐度中呈前期上升的趋势,第16 d之后开始缓慢下降。15盐度组的淀粉酶活性显著高于其他组(P<0.05),其他各组之间无显著差异(P>0.05)。脂肪酶在25盐度组活性最高,盐度升高或者降低酶活性均降低。在10、15、20盐度组中,超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性均维持在较高水平,在相同盐度下,肌肉酶活性低于肝胰脏。     

生物絮团系统在氮转化过程中的微生物多样性变化

通过高通量测序分析生物絮团系统在氮转化过程中的水体菌群多样性变化。试验设置对照组和试验组,对照组水体为清洁的消毒海水,试验组为生物絮团组,试验周期30 d。结果显示:试验组氨氮在第5天达到最大质量浓度(2.99 mg/L),此后降低至趋于0 mg/L;对照组在第9天达到最大质量浓度(7.51 mg/L),之后降低至趋于0 mg/L。试验组亚硝酸盐氮在第17天达到最大质量浓度(12.54 mg/L),之后降低至趋于0 mg/L;对照组在试验周期内呈不断升高的趋势,在第30天达到13.42 mg/L。试验组的硝酸盐氮质量浓度高于对照组,在第30天两组分别达到19.56和6.31 mg/L。生物絮团系统具有明显的消除氨氮和亚硝酸盐氮的能力,试验组的氮转化速率快于对照组。高通量测序显示,生物絮团系统微生物的菌群丰度和多样性指数随养殖周期的增加均显著增加,不同时期差异显著。试验共鉴定出23个门549个属,在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)相对丰度随时间增加而降低(从67.72%降至44.45%),拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)随时间增加而增加(分别从5.99%和6.68%增至16.06%和19.02%)。与氮转化有关的主要的菌有Ardenscatena和Nitrospiraceae(硝化螺旋菌),相对丰度随时间增加而增加(分别从0.34%和0.07%增加至12.69%和0.2%)。生物絮团系统的功能与微生物多样性在养殖周期中呈显著变化。本研究对提高生物絮团系统养殖模式的利用效率具有参考价值。     

以PLA、PHBV为碳源的生物絮团技术在海水养殖中的应用

本研究以聚乳酸(PLA)和3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚(PHBV)作为外加碳源,探究在模拟海水生物絮团养殖中,高、中、低盐度下PLA与PHBV碳源释放规律以及对海水生物絮团养殖中水质、微生物多样性及其群落结构的影响.结果显示:PHBV碳源要优于PLA碳源,中盐度更有利于各种营养盐的转化,氨氮质量浓度最终保持在3...     

Use of Microbial Flocs Generated from Tilapia Effluent as a Nutritional Supplement for Shrimp, Litopenaeus vannamei, in Recirculating Aquaculture Systems

Recovering nutrients in a fish effluent to be used as a supplemental feed for shrimp culture could ease constraints (e.g., environmental issues and high production cost) that have limited the US shrimp farming industry in the past. In this study under laboratory scale conditions, fish effluent was collected from a commercial tilapia farm and nutrients from the waste stream were offered as supplemental feed as either (1) untreated solids from tilapia effluent or (2) microbial flocs generated from the biological treatment of the effluent by reducing soluble chemical oxygen demand >80%. The first feeding trial demonstrated that microbial flocs contributed significantly (P < 0.05) to overall growth while untreated solids did not. Moreover, microbial flocs were larger and contained higher levels (P < 0.05) of protein. The second feeding trial investigated different feeding rates of commercial diets with and without microbial floc supplementation. Weekly measurements of mass and specific growth rates demonstrated that microbial flocs significantly (P < 0.05) contributed to shrimp performance. Weekly food conversion ratios were also reported. Water quality in shrimp systems during both studies was within safe levels, and no differences (P > 0.05) between treatments were observed for dissolved oxygen, nitrate‐nitrogen, nitrite‐nitrogen, pH, salinity, total ammonia nitrogen, and temperature.     

不规则盐度脉冲对许氏平鲉氨氮、磷排泄的影响

在静水系统中,骤然改变水体盐度,形成盐度脉冲;研究许氏平鲉Sebastodes fuscescens(Houttuyn)经历该脉冲后其氨氮、活性磷酸盐排泄的情况。结果表明,盐度改变后,许氏平鲉的氨氮排泄率比正常盐度(30)下呈现出不同程度的升高趋势;当盐度由30降为25和20时,随着体重增加,氨氮排泄率先增大,后又减小;当盐度由30上升为35时,氨氮排泄率随体重增加而呈下降趋势。盐度改变后,许氏平鲉的活性磷酸盐排泄率随体重增大呈先增大后减小的趋势。在同一体重下,盐度由30降至20时,活性磷酸盐的排泄率最大;盐度由30升至35时,磷的排泄率最小。方差分析表明,盐度脉冲对许氏平鲉氨氮排泄率有显著的影响(P<0.05),对活性磷酸盐排泄率的影响不显著(P>0.05)。该研究对于鱼类养殖的水质管理、养殖场的布设等有重要的指导意义。     

Effects of abrupt salinity increase on nitrification processes in a freshwater moving bed biofilter

The nitrification process is a widely used biological approach responsible for ammonia and nitrite removal in recirculating aquaculture system (RAS) biofilters. Given this pivotal role, the influence of different water quality parameter on nitrification efficiency is important information for RAS operations. One influencing parameter is salinity, and salinity fluctuations in freshwater RAS biofilters are reported to affect the nitrifying bacteria. This study investigated the effects of abrupt increase in salinity in freshwater RAS on substrate-dependent (1’-order) as well as substrate independent (0’-order) nitrification rates. A 100% inhibition was found for surface specific removal (STR) of total ammonia nitrogen (TAN) and surface specific nitrite removal (SNR) when salinity was abruptly increased to 25‰ and above. A fast turnover (i.e. steep decline in [NH₄-N⁺] and [NO₂-N⁻]) were observed at lower salinities (≤10‰), while limited/no degradation of either ammonia or nitrite was seen at salinities above 25‰. At low substrate loading (1’-order process), removal rate constants (k_1a) of 0.22 and 0.23 m d^-1 were observed for ammonia and nitrite degradation, respectively, declining to 0.01 m d^-1when adding marine RAS water increasing the salinity to 15‰. Similar observations followed at high nutrient loadings (0’-order process) with STR and SNR of 0.10 and 0.12 g N m^-2 d^-1, respectively, declining to 0.01 g N m^-2 d^-1 at 15‰. When salinities of 25‰ and 35‰ were applied, neither TAN nor nitrite degradation was seen. The results thus demonstrate a pronounced effect of salinity changes when freshwater RAS biofilters are subjected to fast/abrupt changes in salinity. RAS facility operators should be aware of such potential effects and take relevant precautions.     

海马齿对海水养殖系统中氮、磷的移除效果研究

大量的外源性饵料和排泄物使海水养殖水体N、P以及有机物大量增加,导致水质恶化,是制约海水养殖业发展的主要因素。通过构建海马齿面积比为3∶2盐度为15的A、B 2组浮床海水养殖系统,以检验海马齿的N、P移除能力。结果显示,当海马齿处于生长启动期,A组和B组的水质指标与对照组之间无显著性差异（P〉0.05）;但当海马齿生长...     

饲料源Cu(Ⅱ)在生物絮团水产养殖系统中的积累及其对氨氧化的影响

为提高生物絮团技术的安全性,试验探究硝化型生物絮团水产养殖系统中饲料源铜Cu(Ⅱ)的积累情况和Cu(Ⅱ)对生物絮团氨氧化的影响.通过对生物絮团养殖系统中的水体铜Cu(Ⅱ)和絮团中Cu(Ⅱ)含量进行测定.结果显示:养殖系统中水体Cu(Ⅱ)含量随着饲料投喂而不断上升,在投喂91 d后达到(18.34±0.77)μg/L,絮...     

一株高效脱氮菌株的分离鉴定及应用潜力分析

为了获得对虾养殖池塘中高效去除亚硝态氮和氨氮的菌株,采用富集培养分离的方法,从养殖水体中筛选得到1株去除亚硝态氮和氨氮的菌株,培养24 h后的去除率分别为96.17%和88.27%,编号为O-11。基于形态学、分子生物学及生理生化鉴定结果,明确了该菌株基本生物学特征以及可能的分类地位。分离菌株在20~30℃时有利于亚硝态氮的去除,而温度为20~35℃时对氨氮的去除效果较好;分离菌株在盐度小于30的环境中对亚硝态氮的去除能力受盐度变化的影响不大;在碱性环境中分离菌株对氨氮的去除能力较高。安全性检验可知,在菌浓度为10~5~10~8 cfu/mL的菌株O-11对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是安全的,且在菌浓度为10~5 cfu/mL时能显著提高对虾的存活率,促进对虾生长。这说明,分离菌株O-11在水产养殖水体中有害氮脱除方面具有潜在的应用价值。     

Effect of dietary protein level on growth, survival and ammonia efflux rate of Litopenaeus vannamei (Boone) raised in a zero water exchange culture system

Litopenaeus vannamei postlarvae (1.96±0.07 g) were reared in a zero water exchange system for 25 days at 28°C. They were fed four commercial diets containing 25%, 30%, 35% or 40% crude protein in three replicate aquaria per dietary treatment. Total ammonia, nitrite, nitrate and pH were monitored weekly and total ammonia levels were additionally measured every 3 days using the flow injection analysis method. Total ammonia efflux rates were measured at days 0, 14 and 21, and survival and growth rates were recorded at the end of the experiment. No significant differences between water quality parameters such as temperature, salinity, dissolved oxygen and pH were found. Nitrite concentration remained low in all dietary treatments up to the second week increasing considerably from day 14 onwards suggesting the initiation of the nitrification process. Water total ammonia of all experimental groups exhibited a gradual increase up to day 13; however, following this time ammonia levels of all experimental groups decreased, probably due to either the action of bacterial nitrification or ammonia‐N uptake by the animals. High ammonia efflux rates were recorded at day 14, especially after the first hour of immersion in the 25% protein group, but no significant changes occurred in any experimental group after 3 h. No significant differences in weight gain, final weight or survival of shrimp were observed under these experimental conditions. The importance of zero water exchange systems and their effects on the nitrogen metabolism of crustaceans are discussed.     

一种微生物絮团的生化分析及其对对虾免疫力的影响

利用红糖与尿素为碳氮源在自然海水中培养微生物絮团,获得絮团产物,对该产物离心后进行初步的生化分析表明,絮团产物上清液中微生物胞外产物重均分子量为213281Da。絮团沉淀物中多糖含量占29.6%,氨基酸含量占12.6%。将絮团产物按0、0.02、0.1、0.5、2.5%的比例添加至低蛋白饲料中投喂凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei),14d后分别测定实验对虾血清溶菌活力、抗菌活力和酚氧化酶活力,结果显示在饲料中添加微生物絮团浓度为2.5%的对虾血清中抗菌与溶菌活力最高(P<0.05),添加微生物絮团浓度为0.5%与2.5%的对虾血清中酚氧化酶活力较低蛋白饵料对照组显著提高(P<0.05)。用哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染实验对虾后,结果显示饵料中添加0.1%微生物絮团产物组对虾的死亡率最低。综合分析认为对虾摄食微生物絮团后,能够显著提高对虾的非特异免疫力,抗微生物感染的能力得到增强。