大豆花叶病毒种子带毒检测的研究

带毒种子是大豆花叶病初侵染的唯一来源,种子带(传)毒率高低影响田间发病基数和病害的扩展流行,也是评价品种抗性的一个重要指标。因此,摸清和掌握大豆品种的带(传)毒情况及检测方法,在生产中有重要的经济意义。为此,我们在筛选种传率低的品种过程中,对此项工作做了初步摸索。     

利用RT-PCR方法检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒

通过设计特异性引物SQCPF/SQCPR,扩增南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)CP基因的保守序列,进行RT-PCR,对扩增得到的特异性片段进行序列测定,测序结果显示扩增产物序列与GenBank中登录的SqMV外壳蛋白基因存在87%～96%的一致性;建立了适用于检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒的RT-PCR结合ELISA方法,通过在酶联板的反应孔中直接进行反转录合成cDNA,能扩增到预期大小的DNA条带,且检测灵敏度高于DAS-ELISA方法10倍以上。用建立的RT-PCR结合ELISA方法检测进境甜瓜种子携带的SqMV,在42份样品中检出4份阳性样品。     

菜豆种子中菜豆普通花叶病毒的RT-PCR检测

为研究国家作物种质库中保存菜豆种质携带种传菜豆普通花叶病毒（BCMV）的状况，根据BCMV的印基因序列设计一对特异性引物，从BCMV侵染的菜豆叶片上扩增出与理论大小一致的714bp的片段。在此基础上，应用改进CTAB法从菜豆干种子中提取总RNA并特异性扩增出相同大小的片段。对目的片段进行克隆、测序和序列同源性比较，结果表明，扩增片段的序列与其它BcMV的印基因序列同源性达88％-98％，确证该方法可以从莱豆干种子申直接检测BCMV。利用建立的方法，分别从单粒菜豆种子样本和30粒菜豆种子样本中检测到BCMV，其检测灵敏度较ELISA方法更高。来自河北的紫芸豆单粒种子带毒率高达100％，而在不同地理来源的6份菜豆种质中，4份被检出携带BCMV，表明入库保存的菜豆种质和种子已普遍为BCMV所侵染。     

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT-PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT-PCR试剂盒和本文实验的一步法RT-PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法.     

从进口美国大豆中检出大豆花叶病毒

近年,我国从国外进口大豆数量迅猛增加,为防止危险性病毒随进境大豆传入,我们开展了大豆病毒检疫工作。主要针对一、二类检疫性病毒及部分具检疫重要性的病毒进     

微滴数字RT-PCR检测南芥菜花叶病毒

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,ARMY)的微滴数字RT-PCR方法,根据ArMV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估.结果 表明,该数字RT-PCR检测方法的特异性好,与其他对照病毒均无交叉反应;检测灵敏度可...     

利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因（CP基因）保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。     

福州和成都竹花叶病毒的RT-PCR法检测

 竹花叶病毒(Bamboo mosaic virus, BaMV)是马铃薯X病毒属唯一携带有卫星RNA的成员,目前已经在巴西、美国以及中国台湾等地的竹类栽培区产生危害,严重影响竹材的经济价值,而在中国大陆还不曾有相关报道。根据GenBank上报道的BaMV和其伴随卫星RNA(satBaMV)序列以及未公布的序列分别设计了1对特异性引物,在优化RT-PCR条件的基础上,成功建立了BaMV的RT-PCR检测方法。 CpC-F/R用于扩增部分BaMV-CP序列(527 bp),SaC-F/R用于扩增satBaMV部分序列(472 bp)。把所建立的方法用于检测分别采自成都和福州的不同品种竹子病叶,结果均检测出了BaMV和satBaMV,而无症样品未得到任何产物。本研究在基因水平上为BaMV的检测提供了快速、准确、灵敏的新体系,为我国竹类栽培过程中竹花叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

建兰花叶病毒厦门分离物的提纯及RT-PCR检测

以蔓陀罗为建兰花叶病毒(CyMV)厦门分离物的繁殖寄主,通过一次差速离心、一次PEG沉淀结合超速离心提纯建兰花叶病毒,病毒得率约400 mg/kg。根据已经报道的建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,分别以该病毒RNA及病叶总RNA为模板,建立了建兰花叶病毒RT-PCR快速检测体系,其检测灵敏度可达1.8 pg病毒和11 mg/mL的病叶组织。     

进口美国大豆上发现大豆花叶病毒

大豆作为种子在我国是禁止进境的,但是每年仍有相当数量用作榨油的大豆经口岸入境。１９９７年１２月由烟台动植物检疫局送检的美国大豆,经隔离温室种植观察,发现了一株大豆花叶病毒,现报告如下。１材料与方法１．１应检样品来自美国路易斯安那州的大豆（ＵＳＡ．Ｎｏ...     

一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒方法的建立

本研究采用Trizol快速提取植物叶片总RNA，通过GeneBank设计特异性引物，并利用一步RT—PCR技术，最终建立了一套比较实用的检测ArMV的方法。该方法对于其它病毒的检测同样具有借鉴意义。     

实时荧光RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CymMV）是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。     

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。     

实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein, CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。     

进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获巢式RT-PCR检测

利用DAS-ELISA对进口大豆上BPMV进行检测发现,从美国进口的部分大豆样品对BPMV的多抗血清呈阳性反应;利用免疫吸附电镜观察发现,ELISA检测阳性的大豆种皮病汁液中存在直径约30nm的球状病毒粒子.根据BPMV外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对嵌合引物,建立了BPMV的高灵敏的免疫捕获巢式RT-PCR（IC-nested RT-PCR）检测方法.该方法经免疫捕获、反转录和2轮PCR扩增,能从带毒大豆种子中扩增到预期大小的DNA条带.序列测定与分析表明此条带的序列为BPMV部分CP基因,在系统关系树上与BPMV的其它分离物形成一簇亲缘关系很近.实验表明从进境大豆上检测到了BPMV.     

半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究

 菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。     

应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒

应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒(LMoV)进行RT-PCR检测.结果表明,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段.将感染LMoV组织总RNA以10倍梯度稀释成不同浓度检测,特异引物检测的灵敏度为10-4,简并引物的灵敏度为10-3.对特异引物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为90%～99%,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠.