海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

陆地棉GhPLDα基因的克隆、序列分析及表达

[目的]棉花磷脂酶D(GhPLDα)基因的克隆、序列功能结构域分析及表达.[方法]以陆地棉胚珠和纤维为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,利用分光光度法检测酶活性,采取RT-PCR方法检测基因表达.[结果]从发育的棉花胚珠和纤维混合材料中克隆得到的磷脂酶基因的开放读码框为2 421 bp,编码包含807个氨基酸的蛋白质,分子量约为88 kDa.通过同源序列比对和功能结构域分析,GhPLDα具有典型的磷脂酶D家族(HKD)结构域,同时还存在蛋白激酶C结构域2(C2结构域).构建了pET28a-GhPLDα原核表达载体;获得分子量约为88 kDa左右的重组蛋白GhPLDα.半定量RT-PCR结果表明GhPLDα基因可能参与棉花胚珠与纤维发育过程.[结论]GhPLDα基因的克隆、序列分析和表达为进一步研究棉花GhPLDα基因在胚珠和纤维发育中过程的功能奠定了基础.     

棉花GhGGPase基因克隆、序列分析及原核表达

[目的]棉花GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GhGGPase)基因的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]利用RT-PCR技术从棉花纤维中克隆棉花GhGGPase基因,进行生物信息学分析,构建原核表达载体pET28a-GhGGPase,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达.[结果]从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因的cDNA开放读码框为1350 bp,为包含450个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为49 kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,GhGGPase蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域.进化树分析的表明棉花GhGGPase与柑橘CuGGPase在进化上亲缘关系上较近.成功构建了pET28a-GhGGPase原核表达载体;获得分子质量约为49kDa左右的重组蛋白GhGGPase.半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhGGPase基因与棉纤维的快速伸长发育密切相关.[结论]GhGGPase基因的克隆、序列分析和重组蛋白的诱导表达为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

海岛棉一个成花素类似基因的克隆和生物信息学分析

[目的]海岛棉成花素类似基因的克隆及生物信息学分析.[方法]利用RT - PCR技术,从海岛棉中克隆成花素FLOWERING LOCUST(FT)的同源基因,并进行生物信息学分析.[结果]从新海14号花后15 d纤维中,克隆到一个棉花成花素类似基因FLOWERING LOCUS T- LIKE1,命名为GbFTL1.该基因的开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.蛋白比对表明bFTL1和AtFT的相似性为79.3;,和陆地棉GhFTL1的相似性为99.4;,GbFTL1第37位氨基酸为Asn(N),而GhFTL1第37位氨基酸为Ser(S).GbFTL1含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及14个保守氨基酸,系统进化树分析表明GbFTL1属于FT亚家族成员.[结论]GbFTL1基因可能为海岛棉中促进开花的基因之一.     

海岛棉单萜合酶基因克隆及其受黄萎病诱导的表达分析

[目的]克隆海岛棉品种新海15中单萜合成酶基因(GbTPS),研究其受黄萎病诱导的表达情况,为进一步研究该基因在棉花抗黄萎病中的功能打下基础.[方法]克隆Gb TPS基因的开放阅读框(ORF)全长序列,对其蛋白序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR及病毒诱导的基因沉默对其抗病性进行分析.[结果]通过PCR扩增得到一个全长为1761 bp的ORF序列,命名为Gb TPS(GenBank登录号:KP247548).生物信息学分析发现,该基因编码586个氨基酸,预测分子量为67.7 kD,等电点为5.79.系统进化树分析结果表明,GbTPS属于Tps-g亚家族.GbTPS基因经黄萎病菌诱导后,表达量在4~24h内显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空白对照组.病毒诱导的基因沉默受黄萎病诱导后其病情指数为52.38,与对照组相比并无明显差异.[结论]GbTPS基因仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用.     

南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表达稳定性分析

[目的]克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.[方法]RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.[结果]克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.[结论]WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究.     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析

[目的]研究海岛棉与陆地棉纤维不同发育时期C4H1基因的表达和结构差异.[方法]分别从海岛棉和陆地棉纤维中克隆C4H1基因的cDNA全长,并利用DNAMAN、MEGA3.1等软件进行C4H1基因的生物信息学分析;采用半定量和实时荧光定量PCR方法,比较海岛棉和陆地棉不同发育时期的棉纤维中C4H1基因的表达水平.[结果]C4H1基因在海岛棉与陆地棉纤维发育不同时期表达具有差异,海岛棉中该基因的表达高峰期在20 DPA,而陆地棉中该基因的表达高峰期在15 DPA.该基因的核酸序列在两种棉花中存在差异,并导致其编码蛋白的氨基酸序列也存在差异,且海岛棉C4H1蛋白中Thr(苏氨酸)含量高于陆地棉,蛋白等电点也耍高于陆地棉.[结论]海岛棉中C4H1基因的表达高峰期晚于陆地棉,两个棉种C4H1蛋白氨基酸序列的差异可能导致其理化性质及生物学功能的改变,为发掘海岛棉纤维品质优异基因奠定了基础.     

黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因的克隆及蛋白结构预测和功能分析

采用分子克隆技术克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原(TRY)基因,并运用多种生物信息学软件对TRY蛋白质结构和功能进行了分析和预测,研究TRY在禽类消化过程中的作用.结果表明:黄羽肉鸡TRY基因的开放阅读框全长747 bp,由248个氨基酸残基组成,其中包含15个氨基酸的信号肽(MKFLVLVAFLGVAVA)和10个氨基酸的激活肽(FPISDEDDDK);该蛋白分子质量为26.1 ku,含有信号肽,不含有糖基化位点,有11个磷酸化位点;此外,该蛋白属于疏水性蛋白,但不存在跨膜区.氨基酸序列比对的结果表明:黄羽肉鸡TRY具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(组氨酸-64、天冬氨酸-110和丝氨酸-203);具有构成6个二硫键所需的12个半胱氨酸残基等.序列一致性分析表明,黄羽肉鸡TRY与纯种鸡的同源性最高,达98.8%.     

陆川猪脂蛋白脂酶基因的克隆与序列分析

[目的]对陆川猪脂蛋白脂酶(LPL)基因进行克隆与序列分析,为后期开展LPL基因表达与陆川猪肌内脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已公布的猪LPL基因序列设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增其LPL基因,测序结果用Lasergene 7.0软件进行序列分析,用MEGA 6.0软件进行同源性比较及构建系统进化树,同时利用在线蛋白质结构分析软件(PMP)预测陆川猪LPL蛋白二级结构.[结果]成功克隆获得陆川猪LPL基因编码区长1437 bp,与GenBank中已公布普通猪、大白猪、杜洛克猪、通城猪、贵州白香猪的基因同源性分别为99.6%、99.7%、99.7%、99.7%和99.4%.陆川猪LPL基因第760位点存在特有的碱基A,该突变导致缬氨酸突变为蛋氨酸.由基于LPL基因碱基同源性构建的物种系统进化树可知,广西陆川猪与大白猪的遗传距离最近,其次是山羊,最远的是小鼠.蛋白二级结构预测结果表明,陆川猪的LPL蛋白二级结构包含有N-端结构域和C-端结构域两个区域,且存在PLAT/LH2.[结论]LPL基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的主要候选基因之一.     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（EST contig110和EST contig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列EST contig110和EST contig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对EST contig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

棉花深棕色纤维基因Lc1的遗传定位

 【目的】研究棉花棕色纤维的遗传规律,寻找并定位与棕色纤维基因连锁的分子标记,为进一步在棉花基因组学水平上定位、克隆棕色纤维基因和棕色棉纤维品质改良奠定基础。【方法】基于陆地棉显性多基因标记系T586（具有深棕色纤维基因Lc1）与海岛棉新海16配制的海岛棉×陆地棉杂交F2群体,结合色彩色差仪对棕色纤维色泽的分类进行分析,并充分利用棉花基因组分子标记遗传连锁图谱信息、多态性分子标记筛选和图位克隆的方法,定位与棕色棉纤维基因Lc1连锁的分子标记。【结果】根据T586与新海16杂交后代F2群体（443个有效纤维单株）深棕色纤维、棕色（中间色）和洁白色纤维的分离比例,将Lc1定位于棉花基因组A亚组第7染色体微卫星标记NAU4030和CGR5119之间约8 cM的遗传距离内,其中,Lc1与标记CGR5119的遗传距离约为2.8 cM,与NAU4030之间的遗传交换距离约为5.1 cM,构建了Lc1位点的遗传连锁图谱。【结论】棉花深棕色纤维性状由单基因控制并呈现半显性遗传方式,Lc1位点附近的分子标记信息可在棕色棉分子标记辅助育种中得以利用。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85 A2-1的克隆与功能分析

[目的]研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源.[方法]采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhC-YP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-in...     

利用Mascot程序与家蚕EST数据对质谱数据进行鉴定

【目的】研究和检验利用Mascot程序与家蚕EST数据解析质谱分析的结果,鉴定目标蛋白的方法。【方法】将家蚕5龄起蚕中肠总蛋白进行二维电泳分离,并运用质谱对80个蛋白点进行肽指纹图谱分析,利用Mascot程序和经自主编制软件Transeq翻译的EST序列数据库对所得质谱数据进行鉴定。【结果】鉴定出其中41个蛋白,并利用EST电子克隆在其余39个蛋白中得到19个蛋白的全长或较长cDNA。【结论】本文提出的利用家蚕EST数据来解析家蚕蛋白质谱结果的方法,能够鉴定仅利用公共数据不能鉴定的蛋白,并能鉴别基因可变剪接后产生蛋白异形体的问题。     

小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（TaCKX5）的克隆及其染色体定位

【目的】克隆小麦的TaCKX基因并对其序列进行生物信息学分析,明确TaCKX基因在小麦基因组中的分布情况,以期为今后深入研究小麦CKX基因以及利用该基因进行小麦重要农艺性状的遗传改良奠定基础。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,通过小麦缺体-四体对其进行染色体定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1 596 bp,编码531个氨基酸,含有CKX基因家族典型的功能位点FAD-binding domain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。使用中国春缺体-四体将TaCKX5定位于小麦第三同源群。系统发育分析表明,CKX基因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。【结论】分离获得了普通小麦TaCKX5基因全长,TaCKX5分布于小麦染色体3A、3B、3D上,与水稻OsCKX5基因直向同源。     

条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483 bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列,其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明,TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调,成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因,该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。     

小麦蒜氨酸酶基因TaAly1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。     

白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白的克隆、定位及表达分析

 【目的】克隆受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因,分析其在感、抗病单株中的表达模式,探讨其在小麦抗白粉病过程中的作用机制。【方法】根据基因芯片结果,结合电子克隆与RT-PCR方法,克隆到一个受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因。通过中国春缺体-四体系对获得的基因片段进行定位。运用荧光定量PCR方法分析了该基因片段在抗病植株、感病植株白粉菌诱导的时空表达模式。【结果】获得了一个具有完整开放阅读框的小麦类萌发素蛋白基因片段,命名为TaGLP5(GenBank 登录号为FJ594470)。系统进化分析表明该基因片段与已知的来自禾本科的萌发素蛋白分属不同的进化分支,很可能是新的小麦萌发素蛋白成员。通过中国春缺体-四体系将该基因片段定位在小麦的5A染色体上。定量PCR分析结果表明,该基因的表达受白粉菌诱导,且在接菌后的24 h以前抗病中的表达量高于同期感病株。【结论】本实验获得的类萌发素蛋白是一个新的成员。该类萌发素蛋白在感、抗植物受白粉菌诱导上调表达,但是表达量、表达时间上存在差异。推测该基因参与了小麦对白粉菌的防御反应。