梅花鹿IFN-α基因的克隆与原核表达研究

为研究梅花鹿IFN-α的抗病毒功能和分子机制,根据GenBank中牛IFN-α基因序列(A00145),设计并合成1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因核苷酸序列。序列分析表明梅花鹿IFN-α基因全长570 bp,编码189个氨基酸,其中含18个氨基酸的信号肽和169个氨基酸的成熟多肽,存在1个潜在跨膜区,基因随不同物种发育进化地位表现出种属间的差异性。在此基础上,合成1对引物,扩增梅花鹿IFN-α成熟肽核苷酸序列,构建pET28a-IFNα原核重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在24 kd左右出现特异性蛋白带,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的34.04%,且表达产物与抗His标签抗体可发生特异性反应。将Ni柱纯化的pET28a-IFNα诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具抗病毒活性。研究结果为梅花鹿IFN-α蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。     

梅花鹿IFN-β1基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中牛干扰素-β1(IFN-β1)基因序列(E00137),设计并合成了1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-β1全基因,并克隆、测序。结果表明:梅花鹿IFN-β1基因全长561 bp,编码186个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸,3个糖基化位点,成熟蛋白含有4个α螺旋,3个β折叠区,7个β转角。序列比较分析发现,梅花鹿IFN-β1基因序列与GenBank发表的23种IFN-β1基因核苷酸序列同源性为3.2%⁹1.1%,氨基酸序列同源性为21.9%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%⁷9.7%。梅花鹿与其他23种动物的IFN-β1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-β1基因存在种属特异性。梅花鹿INF-β1基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-β1基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

重组猪IFN-λ3原核表达及其活性分析

应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

水貂IFN-β基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR方法克隆得到β干扰素基因(IFN-β),将IFN-β成熟肽插入原核表达栽体pET32a,在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白.结果表明,IFN-β片段长561 bp,与已报道的水貂IFN-β基因相比较同源性为100%,IFN-β成熟肽可编码179个氨基酸.重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子质量约为34 ku,与预期结果相符.     

梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素（DuIFN—α）并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a＋连接后转化到BL21（DE3）获得工程菌BL21（DE3）／pET32a＋DuIFN—α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒（VSV）、鸭瘟强毒（DPV）活性进行研究。结果表明：BL21（DE3）／pET32a＋-DuIFN-α经0．4mmol／LIPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质（Ni—MIAC）进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12800U／mg;利用定量PCR检测到15U／mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN—α的临床应用提供试验数据。     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β基因在大肠杆菌中的表达及其抗病毒活性比较

构建了惠阳胡须鸡IFN-α/pGEX-6P-1I、FN-β/pGEX-6P-1的重组质粒,并在BL21中表达,对重组蛋白进行了抗病毒活性测定,结果表明IFN-αI、FN-β重组蛋白的抗病毒活性分别为7.9×105U/mg和6.4×104U/mg,IFN-α的抗病毒活性是IFN-β的12倍。IFN-αI、FN-β与干扰素受体具有不同的结合位点和结合途径可能是使IFN-α和IFN-β的生物学活性存在较大差异的原因。     

长白山梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因克隆及原核表达

为了研究S100A4蛋白在鹿茸发生过程中的生物学功能,构建长白山梅花鹿鹿茸S100A4基因原核表达载体,并进行BL21原核表达;自鹿茸骨膜中提取总RNA,逆转录成c DNA,以特异性引物扩增S100A4,扩增产物克隆到p MD18-T载体并测序鉴定,将目的片段和原核表达质粒p ET-15b分别用Bam H I和HindⅢ双酶切并连接,再将重组质粒转入BL21用TPIG进行诱导表达;结果通过序列的对比分析,S100A4基因是一个相对保守的基因,与多个物种的匹配度达到90%,与牛S100A4基因同源性最高,达到98.4%;成功构建了p ET15b-S100A4表达质粒,转化BL21诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测显示表达的蛋白分子量为11 k D,与预期一致。表明梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因的可以在原核中克隆、分析和表达,为真核表达和进一步的蛋白功能分析奠定了基础。     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

水貂IFN-α基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。     

猪IFN-β的克隆与原核表达

根据已发表的AY687281基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法从长白猪白细胞基因组中扩增到猪β干扰素基因,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定。序列分析表明,获得的猪β干扰素基因全长561bp,编码186个氨基酸,与GenBank中AY687281基因序列同源性达99.2%,在28、34、128位核苷酸发生了点突变,由G变为A,由C变为G,由A变为G,由C变为T,导致10、12、43位氨基酸由A变为T,L变为V,E变为G,而在177位点核苷酸的突变没有改变氨基酸。将该基因克隆到pEGX-4T-1表达载体中,转化宿主菌Rosetta,对猪β干扰素进行原核表达。重组表达菌经IPTG诱导后,得到高效表达,所表达蛋白约为43 000,占总蛋白的39.3%,表达产物主要为包涵体。纯化后的包涵体具有抗病毒的生物学活性,能抑制口蹄疫病毒（FMDV）增殖。     

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

为进行西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1蛋白的免疫学研究,通过PCR方法扩增WNV NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP).NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,约占可溶性菌体蛋白质量的50%.利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60%,westem blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性,为进一步开展关于WNV NS1蛋白的研究奠定了基础.     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。     

重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的原核表达

本试验旨在对重庆地区羊口疮病毒(ORFV)进行分离培养及鉴定,并研究其F1L基因序列在大肠杆菌中的表达情况.利用MDBK细胞对疑似ORFV感染的羔羊痂皮中的病毒进行分离培养;对F1L基因序列进行PCR扩增,引入限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ,构建重组质粒pET-32a-F1L,转化至大肠杆菌BL21菌株后,对阳性菌株进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定.结果表明,所获得的毒株为ORFV,其F1L基因在大肠杆菌中的表达产物大小约为57.4 ku,主要以包涵体形式存在,5 h为最佳诱导表达时间,并具有良好的反应原性.     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，经鉴定后得到了重组质粒pBAD-VP1。将此重组质粒转化到受体茵TOP10中，分别以不同浓度的诱导剂L-阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，以终浓度为0．02g／L的L-阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达可达到高峰，表达产物大小约为40ku。软件扫描结果显示，VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的26．3％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体，经过洗涤后制成油乳荆疫苗，经皮下注射免疫豚鼠，用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数，并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明，用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体，并对病毒的攻击提供免疫保护。     

梅花鹿胸腺素β4基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建梅花鹿胸腺素β4(Tβ4)基因真核表达载体,使用TRIzol法提取梅花鹿鹿茸总RNA,RT-PCR方法特异性扩增梅花鹿Tβ4基因,目的基因插入真核表达载体VR1012构建表达质粒,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞系,使用Western blot和免疫荧光方法检测目的基因的表达。结果显示:克隆得到的梅花鹿Tβ4基因长度为135 bp,编码44个氨基酸,成功构建真核表达载体VR1012-Tβ4-HA,转染后梅花鹿Tβ4在293T细胞中表达,而且主要表达在细胞浆中。本试验为进一步研究Tβ4在鹿茸生长中的作用奠定了基础。