实时荧光PCR检测鸡GAPDH基因方法的建立

根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料建立了荧光定量PCR法.采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应.实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

沉默羊传染性脓疱皮炎病毒DNA聚合酶基因的RNAi载体的构建

为了构建用于沉默羊传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus,ORFV)DNA聚合酶基因的2种载体,试验选择病毒复制所必需的DNA聚合酶基因作为干扰靶基因,并设计靶基因的扩增引物,经PCR扩增后测序;随后,与Check2载体分别经PmeⅠ和NotⅠ双酶切,酶切后连接产生Check2-靶基因(Check2-D)重组质粒;然后,利用公用网站按照RNAi序列设计的原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的pll3.7载体连接产生pll3.7-shRNA质粒;最后,利用磷酸钙法进行pll3.7-shRNA质粒和Check2-D质粒共转染293T细胞,利用双荧光检测系统试剂盒检测其RNA干扰效果。结果表明:成功构建了pll3.7-shRNA质粒和Check2-靶基因重组质粒,干扰效果最好,可达到91.0%。     

鸡前脂肪细胞中A-FABP基因表达的变化对PPARγ、perilipin和E-FABP表达的影响

本研究以鸡原代前脂肪细胞为实验材料,探讨A-FABP基因在鸡脂类代谢过程中的功能以及该基因与脂类代谢相关7个基因间的调控关系.利用A-FABP基因的shRNA干扰载体和真核表达载体对该基因进行干扰和过表达,分别在干扰和过表达后24、36、48、60和72 h时检测脂类代谢相关基因的表达情况.结果表明,干扰A-FABP后,鸡前脂肪细胞中PPARγ和perilipin基因的表达量在24和36 h时显著低于对照组,在48 h时显著高于对照组,在48和72 h时,E-FABP基因表达量显著低于对照组；过表达A-FABP后,鸡前脂肪细胞中PPARγ和perilipin基因的表达量在24和36 h时显著高于对照组,在48 h时显著低于对照组,在所有检测的时间点E-FABP基因表达均显著下调.结果显示,在前脂肪细胞中,鸡A-FABP表达量的变化影响PPARγ、perilipin和E-FABP的表达.     

皮肤组织特异性VEGF基因抑制表达载体的构建

基于四环素基因表达调节系统,构建可特异性抑制皮肤组织VEGF基因表达的四环素转录沉默子表达载体。设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以人类基因组DNA和实验室现有质粒为模板,分别PCR扩增出皮肤组织特异性启动子K14序列和四环素转录沉默子tet R-Krab序列,依次插入到真核表达载体p CAGGS的多克隆酶切位点,构建p CAGGS-K14-tet R-Krab载体。酶切鉴定和DNA测序结果表明载体构建正确,可以用于小鼠受精卵显微注射。成功构建了可特异性抑制皮肤组织VEGF基因表达的转录沉默子表达载体,为建立皮肤组织特异性VEGF基因抑制鼠模型奠定基础。     

DNA甲基化标记及其在猪生产上的研究进展

<正>表观遗传学是在不影响DNA序列变化的前提下,而发生的可遗传基因表达的变化[1]。DNA甲基化是重要的表观遗传学现象之一,它的主要作用是通过与转录因子相互作用或者改变染色质的结构来抑制基因的表达[2],启动子区和转录起始位点的DNA的甲基化作用尤其突出,DNA甲基化参与生命体活动的很多过程,目前检测DNA甲基化     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

布鲁菌感染小鼠RAW264.7细胞对IRG1基因的表达调控作用

针对小鼠RAW264.7细胞IRG1基因设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRG1基因在RAW264.7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌16M株及M5株感染基因沉默细胞对IRG1基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRG1基因的表达,布鲁菌侵染RAW264.7细胞后IRG1基因表达上调。本试验为IRG1基因及相关调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。     

猪紧密连接蛋白1基因克隆及其shRNA片段的筛选

试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036 bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48 h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1 shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1 shRNA1276 (77.8%和67.0%,P < 0.05)。     

靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1)的shRNA慢病毒表达载体,设计出SynDIG1的siRNA的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,合成的Oligo经过退火分别与双酶切处理后的pLKO.1-GFP载体连接.将构建的重组质粒pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA转化到DH5a...     

布鲁菌感染小鼠RAW264．7细胞对IRGl基因的表达调控作用

针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。     

小鼠MSTN基因RNA干涉载体的构建及干涉效率的检测

为了筛选小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)基因的干涉序列,根据GenBank中小鼠的MSTN基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得MSTN基因序列,构建其真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;根据MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因干涉序列(M1、M2、M3),并构建相应的RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。将构建的真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN单独或分别与3种干涉载体共转染293GP细胞,检测干涉载体对MSTN基因的干涉效率。结果表明:试验成功克隆得到与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列,并构建了真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;与转染pcDNA 3.1(+)-MSTN后的293GP细胞中MSTN基因的相对表达量(1.000)相比,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显下降,pRNAT-M1的干涉效率最高。说明研究成功获得对MSTN基因表达具有明显干涉作用的干涉序列。     

DNA微阵列与基因表达研究概况

DNA微阵列技术是 90年代兴起的一种对成百上千甚至上万个基因同时进行检测的新技术 ,它具有高通量和并行化的特点 ,广泛应用于基因表达、预测基因功能、检测基因突变和多态性分析、发现新药物和药物靶器官以及疫苗设计等方面。文章对 DNA微阵列的基本原理、DNA微阵列制备技术、杂交信号检测以及数据分析。 c DNA微阵列与细胞周期相关基因表达、细菌基因表达、病毒基因表达、肿瘤基因表达进行了概述。     

黔北麻羊SRD5A2基因干扰载体构建及其对产羔相关基因表达的影响

旨在探究SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响。本研究选择健康的（2~3岁）黔北麻羊经产母羊3只,体重约32 kg,采集卵巢组织并成功培养卵巢颗粒细胞。通过在线软件设计SRD5A2基因的4对siRNA干扰序列和1对阴性对照序列,连接pGPH1/GFP/Neo载体后,将构建成功的干扰载体转染至黔北麻羊卵巢颗粒细胞。利用qRT-PCR方法筛选出干扰效率最佳的载体,检测其对SRD5A2基因表达的影响。运用qRT-PCR检测沉默SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因骨形态发生蛋白15（BMP15）、生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白1B（BMPR-1B）和卵泡刺激素β亚基（FSHβ）表达的影响。结果表明,本试验在培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞的基础上,成功构建了黔北麻羊SRD5A2基因的干扰载体,并筛选出shRNA-SRD5A2-1干扰效果最佳（P<0.01）;抑制SRD5A2基因表达后,qRT-PCR检测产羔性状相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均显著降低,BMP15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组（P<0.01）,BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量显著低于shRNA-NC对照组（P<0.05）。本研究成功构建了SRD5A2基因干扰载体并转染至卵巢颗粒细胞,发现体外沉默SRD5A2基因可抑制产羔性状相关基因的表达,提示SRD5A2基因与黔北麻羊产羔性状密切相关,本试验结果为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机制提供了基础。     

Construction of SRD5A2 Gene Interference Vector and Its Effect on the Expression of Lambing Related Genes in Qianbei Ma Goats

The purpose of this study was to investigate the effect of SRD5A2 gene on the expression of genes related to goat lambing traits. In this study, 3 healthy (2-3 years old) and female Qianbei Ma goat with a weight of approximate 32 kg were selected. Ovary tissue was collected and granulosa cells were successfully cultured. Four pairs of siRNA interference sequence of SRD5A2 gene sequence and a pair of negative control sequence were designed by online software. After connecting pGPH1/GFP/Neo vector, the constructed interference vectors were transfected into ovarian granulosa cells of Qianbei Ma goats. The interference vector with optimal interference efficiency was screened by qRT-PCR, and its effect on the expression of SRD5A2 gene was detected. The effects of silencing SRD5A2 gene on the expression of bone morphogenetic protein 15 (BMP15), growth differentiation factor 9 (GDF9), bone morphogenetic protein-1B (BMPR-1B) and follicle-stimulating hormone lactin (FSHβ) were investigated. In this experiment, the interference vector of SRD5A2 gene was successfully constructed on the basis of cultivating ovarian granulosa cells of Qianbei Ma goats. shRNA-SRD5A2-1 interference vector with the optimal interference efficiency was screened out (P<0.01). After inhibiting SRD5A2 gene expression, the expression levels of BMP15, BMPR-1B, GDF9 and FSHβ were significantly reduced. The expression level of BMP15 was extremely significantly lower than that in shRNA-NC control group (P<0.01), and the expression levels of BMPR-1B, GDF9 and FSHβ were significantly lower than those in shRNA-NC control group (P<0.05). In this study, the constructed SRD5A2 gene interference vector was successfully transfected into ovarian granulosa cells. The silencing of SRD5A2 gene can inhibit the expression of genes related to lambing traits, which indicate that SRD5A2 gene is closely related to lambing traits of Qianbei Ma goats, the result will provide a basis for further studies on the regulatory mechanism of SRD5A2 gene on lambing traits in Qianbei Ma goats.     

单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的克隆表达

以单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria Monocytogengs,LMO）LMO-0586基因组DNA为模板,运用PCR扩增得到片段大小为1646bp的致病基因李氏溶血素（hly）基因,并克隆到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-hly。经测序正确后,将hly基因克隆至表达载体pGEX上构建表达质粒pGEX-6P-1-hly。在IPTG诱导下,携带pGEX-6P-1-hlyA的E．coli BL21（DE3）高效表达分子量约为82KDa的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白。为进一步研究溶血素蛋白的结构、功能,LMO的分子流行病学调查、诊断试剂盒的开发提供依据。     

秦川肉牛脂肪细胞PLIN2基因干扰siRNA筛选及过表达载体效率检测

试验旨在获得秦川牛肉用新品系（以下简称"秦川肉牛"）具有高干扰效率的脂肪细胞分化相关蛋白2（PLIN2）基因干扰siRNA及高过表达效率的基因超表达载体,为后续研究PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能提供试验依据。通过采用siRNA介导的靶基因沉默技术合成靶向牛PLIN2 mRNA序列的si-PLIN2及构建真核pcDNA3.1（+）-PLIN2过表达载体,利用FuGENE6低毒性转染试剂配制转染复合物,转染秦川肉牛脂肪细胞并进行诱导分化。采用实时荧光定量PCR检测技术检测各试验组与对照组中PLIN2基因的相对表达量,并计算目的基因干扰及过表达效率;采用Western blotting方法检测蛋白水平的表达情况;采用BODIPY脂滴染色的方法观察表型。结果表明,转染秦川肉牛前体脂肪细胞后干扰组3对si-PLIN2（si-PLIN2_01、si-PLIN2_02和si-PLIN2_03）与对照组（si-PLIN2-NC）相比,PLIN2基因表达量下降（P<0.01）,干扰效率分别为71%、54%和50%;蛋白水平检测发现,si-PLIN2_01、si-PLIN2_03组蛋白水平表达与对照组（si-PLIN2-NC）相比出现下降趋势;脂滴染色后发现,干扰组与对照组相比,脂滴数目明显减少。过表达组pcDNA3.1（+）-PLIN2与对照组相比,PLIN2基因表达量显著上调,达35倍,脂滴数目明显增多。综上所述,siRNA介导的PLIN2基因沉默或pcDNA3.1（+）介导的体外表达载体均可以成功实现对PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的干扰或超表达,并影响脂肪细胞分化过程中脂滴的形成数量。本研究为进一步探究PLIN2在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能奠定基础。     

ARF基因干扰表达对不同发育阶段和贮藏条件马铃薯酶活性的影响

以前期研究获得的马铃薯栽培品种“甘农薯2号”ADP核糖基化因子(ARF)基因干扰表达转化植株为材料,用qRT-PCR法对转基因植株的ARF基因表达量进行了测定,结果表明,不同发育阶段转基因叶片中ARF基因的相对表达量先降低,生长后期略有增加,表明ARF基因干扰表达量随马铃薯生长发育发生改变。ARF基因干扰表达影响马铃薯叶片中酶活性,不同发育阶段转基因叶片与对照相比,多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性升高11.61%~27.84%,硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性提高21.10%~41.32%,磷脂酶D(phospholipase D, PLD)活性降低2.88%~57.64%,蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)活性提高29.00%~39.57%;不同温度(4℃和室温)贮藏的块茎中ARF基因的相对表达量变化趋势一致:均先降低,再升高,但前者较后者ARF基因相对表达量显著降低。室温较4℃贮藏的转基因块茎PPO活性升高30.44%~56.28%,NR活性提高17.41%~40.92%,PLD活性降低24.39%~85.11%,SPS活性提高30.89%~45.78%。室温较4℃贮藏的非转基因块茎PPO活性升高25.11%~70.66%,NR活性提高36.07%~89.62%,PLD活性降低11.35%~72.64%,SPS活性提高27.31%~61.33%。本研究通过探讨ARF基因干扰表达对马铃薯生理生化特性的影响,为进一步研究ARF基因在马铃薯生长发育调控中的作用提供一定的理论基础。     

RNA干涉与基因沉默的研究进展

RNAi是指外源dsRNA引发身体内的基因的同源序列降解,从而表现出基因转录后的沉默后现象,到目前为止在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在这一基因沉默机制。研究表明,RNA干涉与植物中的共抑制、真菌中的基因压制熏很可能具有共同的基本分子机制。它可以用于功能基因组学研究,也可用于克服转基因生物的基因沉默现象,使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达,还用于基因治疗,抑制有害基因的表达等。     

RNAi靶向N基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

根据编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因的序列,设计3个干扰靶位(N12、N23、N26),构建siRNA表达载体,转染Marc-145细胞后接毒,测定病毒TCID50、CPE,并利用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光检测病毒在Marc-145细胞上的复制情况。结果表明,利用RNAi技术靶向N基因,其中N12干扰靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因,所选的干扰靶位是病毒复制的关键性位点。     

含绿色荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒SD-01株US2基因缺失转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据Gen Bank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将PCR产物连入pGM-T载体。用BamHI和EcoR V双酶切重组载体,使US2基因缺失约130bp,将含双loxP酶切位点的EGFP完整表达盒插入BamH I和EcoR V酶切位点之间,成功构建了以US2基因为重组臂的含EGFP基因的转移质粒载体pUS2-loxP-EGFP-loxP。