鸡减蛋综合症病毒DNA片段的克隆及生物素化探针的制备

用EDS-76病毒感染鸭胚,从尿囊液中提取EDS-76病毒DNA。用EcoR I和Sall双酶切后与质粒pT7/T3a-19重组,并转化到大肠杆菌DH_5α中。提取重组质粒,经双酶切后进行电泳分析表明,至少已得到了五种片段的克隆。将其中插入片段约为0.4Kb的重组质粒经光敏生物素标记后作为探针检测EDS-76感染的鸭胚尿囊液提取物,证实了该探针对EDS-76 DNA具有特异性,而且至少可检出1pg的EDS-76 DNA。     

禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因的克隆及表达

提取禽源多杀性巴氏杆菌C48—1的染色体,用“鸟枪法”将酶解染色体DNA片段重组到pBR322质粒载体的Pst I酶切点上,再转化到大肠杆菌RRI中.经耐药表型筛选,在约5000个转化菌中,找出了887个具有重组质粒的细菌株,其一般细菌学性质与大肠杆菌RRI相同,构成了禽多杀性巴氏杆菌C48—1染色体DNA的不完全基因文库.分离提纯保护性荚膜抗原,制备抗血清,用~(125)I SPA固相放射免疫技术,从文库中选出13株阳性表达菌株,与用ELISA法复试结果吻合,其中10号和696号菌株表达较强.对10号和696号菌进行了动物试验,结果1次免疫小鼠分别获3/7、2/7的保护,2次免疫分别获6/11和5/11的保护,与之对照的阴性转化菌(119号)以及大肠杆菌(RRI)则无保护力(0/7、0/10).用快速细菌破碎法对13个阳性菌株进行了检测,其外源基因片段在0.5～5.4kb之间.对10号阳性菌免疫电镜观察,在细胞膜及细胞浆内均可见到高电子密度区,显示出外源基因表达的位置和程度.10号菌的重组质粒命名为PPM10,分子量约为5.16kb,用Pst I酶切PPM10,得到约4.3kb和0.86kb的两个片段,因此插入片段约0.86kb.进一步用内切酶分析,证明该插入片段上无Bam HI、Eco RI、Hind III和另外的Pst I酶切点.     

牛分支杆菌αg85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b.     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段，将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中，并转化至大肠埃希氏菌JM109中；经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern-blotting检测，表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆。     

苜蓿细菌性萎蔫病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析(简报)

利用细菌16S rDNA保守序列通用引物对16sF/16sR对苜蓿细菌性萎蔫病菌的标准菌株(IPQ0019)总DNA进行扩增,得到了大约1.5 kb的片段。将此片段插入到pGEM-T载体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中,经PCR鉴定、限制性内切酶分析及核苷酸序列同源性分析均表明克隆成功。该研究为制备苜蓿细菌性萎蔫病菌的DNA分子探针奠定了基础。     

鼠脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡα）基因的克隆及原核表达

根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ (DNase Ⅱ)基因设计引物,通过RT-PCR 扩增出鼠DNase Ⅱα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109.经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNase Ⅱα基因序列完全一致,大小为1 008 bp.将重组质粒pMD-DNase Ⅱα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定.结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNase Ⅱα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应.     

番鸭细小病毒VP2基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的鉴定

通过DNA重组技术,将克隆到的MDPV-Q和MDPV-26的VP2基因片段,经两种限制性核酸内切酶SaclI和Kp-nl的酶切,将酶切产物再克隆到表达载体pPICZαA中,得到表达重组质粒pPICZαA-M-Q VP2和pPICZαA-M-26 VP2.将这两种表达重组质粒分别转化到毕赤酵母(Pichia Pastoris X-33)中进行表达,经甲醇诱导和SDS-PAGE分析结果表明,MDPV-QVP2和MDPV-26 VP2基因片段的表达产物大小约为73kD,与理论预计相符.此外,本研究还意外地发现,重组质粒转化到酵母菌进行表达,在表达VP2结构蛋白的同时,还表达了一条大小约为60kD的蛋白条带.     

p53调控Nfkbiz基因表达的研究

核因子-κB（NF-κB）在炎症反应中起着关键的促进作用,并且受其他多种因素的调节。Nfkbiz基因编码的IκB？蛋白是IκB家族成员之一,在炎症反应中起着调节NF-κB的作用。本研究采用荧光实时定量PCR分析Nfkbiz基因的表达情况,发现在p53特定刺激源作用下Nfkbiz基因mRNA丰度显著降低。分析Nfkbiz基因序列,发现其基因中存在可能的p53反应元件,通过构建荧光素酶报告质粒及双荧光素酶报告试验和染色质免疫共沉淀试验,证明Nfkbiz基因中含有p53反应元件并且受p53蛋白调节。以上结果初步证明Nfkbiz是受p53蛋白负向调控的靶基因。     

营养对基因表达的调控

随着营养学的深入研究 ,发现日粮中的营养成分可以通过多种途径来调控动物基因的表达 ,从而影响动物机体的代谢过程 ,并最终影响动物的生产。本文从分子基因表达的转录及转录后水平方面对日粮中营养成分的生理作用及在生产上的应用作一简单的概述。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ     

RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株和自然株的HGPRT基因的分离、克隆与比较

参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。     

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析.结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7％～100.0％,氨基酸的同源性为94.7％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7％,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0％.M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8％～100.0％,氨基酸的同源性为94.8％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8％,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0％.4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远.     

UL46基因移码突变对PRV毒力的影响

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(JS-2012株)在Vero细胞上40℃传代培养120代后,获得了1株弱毒株(JS-2012-F120株)。该毒株UL46基因3'端有29个碱基插入,导致了130个氨基酸突变。为了研究UL46基因移码突变对PRV生物学特性的影响,本研究用JS-2012-F120的ΔUL46基因替换了JS-2012的UL46基因,构建了重组病毒JS-2012-ΔUL46,并对该重组病毒、高温传代毒株(JS-2012-F120)及其亲本强毒株(JS-2012)在细胞上的生长特性和对小鼠的毒力进行了比较分析。结果显示,与亲本毒株(JS-2012)相比,传代毒株(JS-2012-F120)病毒滴度明显提高,对小鼠的毒力明显减弱;重组病毒(JS-2012-ΔUL46)在Vero细胞上的生长趋势没有明显改变,对小鼠的毒力减弱。因此,UL46基因移码突变对PRV在Vero细胞上的复制没有明显影响,但减弱了PRV对小鼠的毒力。     

日粮营养成分对动物基因表达的调控

本文综述了近年来有关日粮营养成分影响动物基因表达的研究报道。大量证据表明 ,日粮中的常量养分 ,如碳水化合物、蛋白质、脂肪以及某些微量养分均可在一定程度上影响动物基因的表达 ,这种作用可以发生在转录水平 ,也可以发生在转录后水平 ,进而影响机体的整个代谢过程。上述事实使人们试图通过改变日粮养分组成来达到调控动物生产的愿望变得日益可行。     

反刍动物营养生理的分子生物学研究与展望

本综述讨论了反刍动物营养生理的分子生物学研究。许多研究证明 ,营养可以影响反刍动物生长轴、生殖轴(有关激素、受体) ,代谢以及有关酶的基因表达。机理研究认为营养因子除了作用于基因启动子外 ,还涉及转录后的调节。这是当前营养生理学的重要研究领域 ,它将促进基本理论和新技术的发展     

猪流感病毒（A／swine／Jiangsu／2／2006（H3N2）NS1基因表达产物分析

采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。