应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%~15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。     

灰飞虱传播水稻条纹叶枯病毒的特性

灰飞虱是水稻条纹叶枯病的传毒介体,带毒的长短翅型成虫及各龄若虫均能在秧苗期和分蘖期传毒感病,秧苗感病以卷叶型为主,均相继枯死,分蘖期感病以展叶型为主,病株95％以上不能抽穗结实。主蘖传毒,主蘖及各分蘖均发病,分蘖传毒,仅分蘖发病。带毒雌雄配对繁衍3代,无毒分离率平均为31.38％。带毒虫传毒3min,发病率为2％,传毒2h,发病率达22.5％。带毒率50％以上的群体一生传毒频次为3～5次,10％以下仅1次。各龄若虫及不同成虫1天传毒致病株:秧苗期为0.97株及1.26株:分蘖期为0.45株及0.42株。秧田传毒后,80％以上的隐症病株到本田期才陆续显现病状,故秧田“治虫防病”甚为重要。     

灰飞虱传播水稻条纹病毒的研究综述

灰飞虱在水稻上传播水稻条纹病毒(RSV)造成水稻条纹叶枯病,严重影响水稻生产.笔者对灰飞虱传播水稻条纹病毒的途径与特性、影响传毒的生态因子以及可能的传毒机制等方面的研究进行了汇总,以期加深对水稻条纹叶枯病发生、流行的内在原因的认识,并为该病害的宏观控制提供理论参考.     

水稻条纹病毒对介体灰飞虱生长发育相关基因转录水平的影响

由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是我国粳稻产区的一种毁灭性病毒病害。RSV主要由半翅目昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久增殖型方式传播,与无毒灰飞虱相比,带毒灰飞虱五龄和整个若虫阶段的发育历期缩短,最终羽化的成虫数减少。为了从分子上揭示RSV对灰飞虱生长发育的影响,本文研究了RSV对灰飞虱生长发育相关基因转录水平的影响。将灰飞虱转录组拼接后建立本地数据库,根据黑腹果蝇生长发育基因序列比对出10种灰飞虱同源基因序列,设计特异引物,通过RT-q PCR方法分别对带毒和无毒灰飞虱体内这10种基因的转录水平进行检测。结果显示,在RSV的影响下,8种基因的转录发生显著变化,其中2种蛋白质转录被激活,6种蛋白质受到抑制。动力蛋白和钠钾转移ATP酶转录水平的变化可能影响灰飞虱神经系统发育,造成昆虫行为异常;桩蛋白转录下降会影响翅的发育;与细胞骨架相关的5种蛋白质转录也受到了RSV抑制,可能影响灰飞虱羽化过程。对生长发育基因转录水平的初步探究为更好地理解RSV与灰飞虱的互作奠定了基础。     

防治麦田灰飞虱控制水稻条纹叶枯病试验

连续2a进行防治麦田蚜虫兼治灰飞虱控制水稻条纹叶枯病试验,结果表明,这种方法对秧田和大田条纹叶枯病都有较好控制效果。如果在麦田兼治灰飞虱基础上,再注重秧田灰飞虱防治,则控制条纹叶枯病效果更好。     

灰飞虱携带水稻条纹叶枯病毒检测研究

采用斑点免疫结合(DIBA)与生物测定方法对采自浙江长兴和嘉兴两地的灰飞虱带(传)毒率进行了检测。结果发现,两地灰飞虱均有部分虫口携带水稻条纹叶枯病毒(RSV),平均带毒率为6.15%,传毒率为3.96%;斑点免疫结合(DIBA)测定的灰飞虱带毒率,均高于生物法测定的灰飞虱传毒率,两者之比为1:0.65。该检测结果为病害预测和防控提供了重要科学依据。     

水稻灰飞虱带毒率测定

1979年以来,水稻条纹叶枯病逐年加重,1980—1983年,作者对该病的传毒媒介灰飞虱进行了带毒率测定。结果,流行3年的重病区草海农场,带毒率50.9—89.4％;流行2年的轻病区栋川则为42.0—57.5％。另,雌虫带毒率平均为27.6％,雄虫为72.4％;成虫带毒率为65.6％,若虫为43％。     

灰飞虱不同虫量与水稻条纹叶枯病发病的相关性研究

通过田间水稻1代灰飞虱成虫高峰期罩笼接虫传毒试验,结果表明,带毒灰飞虱属持久性传毒型介体昆虫,并随虫量的增加,水稻条纹叶枯病发病呈上升趋势,以400～600头/m2时发病较为明显。浸种试验显示,用25%咪鲜胺EC(使百克) 10%二硫氰甲烷EC(浸种灵) 12.5%吡虫啉SL浸稻种有控虫防病效果。     

灰飞虱来源的水稻条纹病毒外壳蛋白基因遗传多样性

 采用单雌产卵法获得来自江苏、云南、山东、河北等地灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallén,SBPH）来源的21个水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）分离物,提取灰飞虱总RNA,经RT-PCR扩增,获得21个RSV分离物的包含外壳蛋白（cp）基因在内的约1 000 bp左右的DNA片段。测序结果显示,参试分离物的cp由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。采用DNASTAR软件进行分析,21个灰飞虱来源的RSV-cp核苷酸序列和推导出的编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为95.7%~100%和96.0%~100%。与已报道水稻来源的32个RSV分离物一起进行序列同源性比较和系统进化树分析结果表明,总体而言RSV-cp较为保守,其遗传多样性首先与地缘相关,从地理位置上可以分成中国云南、中国沿海和日本3个地理种群;其次与寄主相关,在同一地理种群中可以划分为灰飞虱和水稻2个寄主种群。     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.     

灰飞虱发生期对水稻条纹叶枯病发生型影响的研究初报

水稻条纹叶枯病由于其传毒、显症的水稻生育期不同,可出现“假枯心”、“黄化枯死”和“假白穗”3种发生型,且以“黄化枯死”型发生重,为害损失最大。根据对飞虱和水稻条纹叶枯病消长动态、发生期距和不同时期防治效果分析,前两种发生型分别由灰飞虱第一代成虫和第二代若虫传毒引起。由此提出药剂防治以水稻秧池和大田并重的治虫防病对策。     

不同水稻品种对灰飞虱若虫生长发育的影响

以江苏地区生产上常用的水稻品种武粳15、武运粳7号、扬辐粳7号和扬粳9538为材料,探讨了水稻品种对灰飞虱若虫发育进程的影响。研究表明,灰飞虱若虫取食武粳15、武运粳7号、扬辐粳7号和扬粳9538后的发育历期分别为17.30d、15.69d、21.14d和20.87d。经方差分析与多重比较,灰飞虱若虫总历期在扬辐粳7号与扬粳9538之间不存在显著差异,这两个品种上若虫的发育历期与武粳15和武运粳7号之间均存在显著差异,同时,武粳15与武运粳7号之间灰飞虱的若虫历期也存在明显差异。这表明水稻品种不同,灰飞虱若虫的发育进度不同。     

灰飞虱冠蛋白的基因克隆与表达分析

灰飞虱Laodelphax striatellus冠蛋白属于WD40重复超家族成员,主要通过结合肌动蛋白调控细胞骨架的动态聚合与解聚。本研究通过RT-PCR克隆并获得了灰飞虱3个冠蛋白coronin 1A、coronin 2B和coronin 7的基因CDS区。系统进化树分析显示,这3个冠蛋白分别属于3个分支,且与褐飞虱Nilaparvata lugens的3个冠蛋白同源性最高,氨基酸序列相似性分别为99.2%、88.2%和82.5%。荧光定量PCR检测结果显示,coronin 1A在成虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫,coronin 2B在雄虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雌虫,coronin 7在雌虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雄虫。而3个冠蛋白基因在唾液腺中的转录水平都显著高于肠道。灰飞虱携带水稻条纹病毒(rice stripe tenuivirus, RSV)后体内3个冠蛋白基因的转录水平显著高于对照,说明冠蛋白可能在灰飞虱传播RSV过程中发挥一定作用,研究结果为深入探究冠蛋白的功能奠定了基础。     

水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学

 采用双向电泳联用MOLDI-TOF-TOF质谱对水稻感病品种武育粳3号和抗病品种KT95-418感染水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）前后的叶片进行蛋白质组学分析。结果显示,RSV基因组编码的病害特异蛋白（disease specific protein,SP）在武育粳3号中的积累量明显高于KT95-418中。其他25个蛋白经质谱成功鉴定,包括RSV NS2蛋白,寄主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。对这些差异表达的蛋白与水稻感、抗病的作用进行了分析。     

灰飞虱体内Wolbachia的检测及三种稻飞虱Wolbachia的wsp基因差异分析

采用PCR方法对灰飞虱感染Wolbachia情况进行检测,并对Wolbachia的wsp基因进行序列测定和系统发育分析,以明确各地区Wolbachia的差异及三种稻飞虱体内Wolbachia的差异。结果表明,12省份21地区灰飞虱群体Wolbachia平均感染率达到96.41%。各地灰飞虱体内Wolbachia不存在明显的地理种群分化。与褐飞虱及白背飞虱体内Wolbachia的wsp序列对比,灰飞虱与白背飞虱的序列一致,而与褐飞虱存在较大差异(相似性83.39%),处于不同的系统进化簇。表明感染白背飞虱与灰飞虱的Wolbachia处于相同株系,而感染褐飞虱的Wolbachia处于另一株系。