猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核衣壳蛋白编码基因序列设计了一对特异性引物P1／P2。扩增出大小为294bp的目的片段；再针对这个基因片段。设计合成4条寡核苷酸探针。其中反向引物的5’端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础。通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测。建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测。与RT—PCR检测方法相比。本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明用该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的，对该病的进行快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp2基因并测序。应用DNAStar 7.0、ClustalX 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%。因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的诊断及检测技术研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是猪群中的一种免疫抑制性传染病,是严重危害养猪业的主要疫病之一,运用各种检测技术对该病做出准确的诊断是预防和控制该病的前提。猪繁殖与呼吸综合征的检测包括检测病毒、检测血清抗体及分型诊断,涉及的技术和方法有病毒分离技术、免疫组化技术、RT-PCR技术、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、酶联免疫吸附试验、基因芯片技术等。每种诊断技术都有其各自的优势和局限性,应根据研究目的及工作条件等予以选择,作者对各种诊断技术的原理、方法及特点进行了概述和比较,并对今后的应用前景和发展趋势进行了展望。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-6.5TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒实验室诊断方法的研究

猪繁殖与呼吸综征（PRRS）自1987年首次在美国发现以来，已给世界养猪业造成了巨大的损失。快速精确的诊断是有效防制该病的前提。随着分子生物学技术的不断发展，已建立了许多敏感性高、特异性强、易于操作的诊断及检测PRRS抗体和抗原的方法。作者就PRRSV实验室检测方法的研究进展进行了概述，为进一步检测和控制该病提供参考。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离与鉴定

试验旨在分离并鉴定从发病猪场分离的一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株。从某疫情猪场病猪体内分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-CHD。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),病毒滴度达10^-6 TCID50/0.1 mL,在Vero与BHK-21细胞上不出现细胞病变。采用间接免疫荧光法(IFA)检测病毒抗原分布在细胞浆中。与VR2332、CH-1a、HUN4序列比对及系统进化树分析结果表明,该分离株属于美洲型PRRSV;与PRRSV VR2332、CH-1a等比对,Nsp2基因序列在2780—2782 nt有3个核苷酸小缺失和2933—3019 nt的87个核苷酸大缺失,属PRRSV变异株。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA方法的建立

本试验通过差速离心法和非线性蔗糖密度梯度离心法纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）。经三氯－三氟乙烷处理后,作为ＥＬＩＳＡ试验的标准抗原,并建立了检测ＰＲＲＳＶ抗体ＥＬＩＳＡ方法。该方法与ＩＦＡ、ＩＰＭＡ和国外同类商品化试剂盒进行了对比试验,表明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测ＰＲＲＳＶ抗体的方法。间接ＥＬＩＳＡ方法在敏感性上要优于ＩＦＡ和ＩＰＭＡ》     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的危害及免疫策略

Porcine reproductive and respiratory syndrome is a serious disease, causing significantly economical impacts on the swine industry worldwide. Because of the mechanism of virus infection, the characteristics of antibody-dependent enhancement and a high degree of variability, the commercial vaccines currently exist defects that can’t completely prevent the respiratory system and placental transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）. Therefore, according to the pathogenic characteristics, PRRSV immune characteristics and biological characteristics, the new vaccines are designed which have important significances to the prevention of the disease.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒安徽株的分离与鉴定

从安徽地区的发病猪场的病料中,分离到3株致Marc-145细胞病变的病毒（命名为AH1、AH2、AH3）,负染电镜观察结果可见直径约50 nm的有囊膜的球形病毒粒子,细胞超薄切片可见病毒粒子分散在细胞浆内,直径为40～80 nm。理化特性研究结果表明,3株分离毒均对氯仿、乙醚、甲醛、温度(56 ℃)敏感;间接免疫荧光试验结果显示,分离株与美洲型PRRS阳性血清反应,发出强特异性荧光;对分离毒株Nsp2基因序列分析发现：安徽分离毒株Nsp2基因存在两处共90个碱基缺失现象,与JXA1 PRRSV变异株亲缘性最近。初步鉴定该分离株为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

为研制特异性敏感性较好的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测和诊断,将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到p ET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达形式为可溶性表达,通过Western blot证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的N蛋白经过超声、离心、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原检测血清中的PRRSV抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了能检测PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法;对方法的特异性和重复性以及与同类成品试剂盒间的应用效果对比进行了试验。结果表明,研究建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中PRRSV抗体、监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪繁殖与呼吸综合征RT-LAMP检测方法研究

应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)ORF7基因保守序列的6个区域设计2对特异引物,经反应体系、反应条件优化及敏感性和特异性试验,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。研究结果表明,该检测方法不需要复杂仪器,仅用一台普通恒温水浴锅,在等温条件(63 ℃)保温1 h,即可完成核酸扩增反应,加入核酸染料SYBR GreenⅠ后,用肉眼即可对试验结果进行准确判定,为田间和基层部门检测猪繁殖与呼吸综合征病毒提供了一种廉价、简便、快速、敏感、特异的新方法。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的严重危害世界养猪业的一种传染病,该病可造成猪的繁殖障碍、呼吸系统病症与生长受阻。本文着眼于PRRSV疫苗的免疫原性、保护效力和安全性,涉及市场上现有的商品化疫苗与已报道的处于试验阶段的相关疫苗研究成果,以期为PRRSV的防控与疫苗研发提供有益的参考。     

百色市高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测结果分析

为评估百色市猪群高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）免疫效果,2012年—2013年在66个规模养猪场和249个农村散养户分别采集猪血清样品465份和644份,使用间接 ELISA 检测 HP-PRRSV 抗体,结果显示,现2012年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率为68．02％,2013年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率为75．32％;HP-PRRSV 一免抗体平均阳性率为63．91％,二免抗体平均阳性率为83．60％;HP-PRRS 灭活苗免疫抗体平均阳性率为75．42％,HP-PRRS 弱毒苗免疫抗体平均阳性率为70．86％。说明2013年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率高于2012年,二免的抗体平均阳性率高于一免;HP-PRRS 灭活疫苗的初步使用效果良好。     

高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是最近 2 0年来才发展起来的一种新的猪病 ,然而它给许多国家的养猪业带来了灾难性的经济损失。 2 0世纪 90年代晚期 ,我国也有暴发该病的报道。为了加强进口检疫以及防止该病的传播 ,目前最主要的是提高对该病的诊断和防制水平 ,文章就有关该病的病理变化 ,诊断方法的研究进展进行了综述     

猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的基质膜（Ｍ）蛋白和核衣壳（Ｎ）蛋白是２种重要的结构蛋白。本试验根据ＰＲＲＳＶ美洲毒株的基因序列,设计了能够扩增Ｍ和Ｎ蛋白基因的１对引物,并在２个引物的两端分别加入ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点,经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了一约９５０ｂｐ的目的基因片段,并将此基因克隆于ＰＢＶ２２０载体,构建了ＭＮ蛋白基因重组质粒ＰＢＶＭＮ,进一步由重组质粒回收ＭＮ基因片段亚克隆于ｐＳＫ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋）测序载体,构建了重组质粒ＰＢＳＭＮ,经部分序列分析鉴定,重组质粒含ＭＮ蛋白基因。此基因的克隆为进一步研究该病毒ＭＮ蛋白免疫学特性及其分子基础和基因诊断技术奠定了基础。     

IFN-γ研究进展及其在猪繁殖与呼吸综合征研究中的应用

γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)是干扰素的一种,又称为Ⅱ型干扰素或免疫干扰素,主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ是动物机体最重要的细胞因子之一,是主要的巨噬细胞活化因子(macrophage activating factor,MAF),具有强大的免疫调节作用和抗病毒、抗肿瘤作用。目前,干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛关注,已被应用于人类疾病临床治疗和动物疾病防控研究。作者就IFN-γ的基本特征、生物学活性、检测及其在猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)中的研究应用进行了综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒实验室检测技术研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床症状表现为母猪繁殖性能下降、不孕、流产等。感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后病理及组织学变化往往不太典型,而且易与其它病原感染所引起的病理变化相混淆,给该病的诊断带来一定困难,因此,对于PRRSV的确诊有赖于实验室诊断,不同的诊断方法敏感性、特异性及成本方面存在差异,而现有的血清学方法无法区分疫苗抗体和野毒抗体。作者就PRRSV抗原或抗体的检测技术（如病毒分离、RT-PCR、免疫过氧化物酶技术、酶联免疫吸附试验等）的研究现状作一简单的概述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。