巴西橡胶树抗氧化胁迫基因—超氧物歧化酶基因 的遗传转化及植株再生

本研究采用农杆菌介导法成功实现巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis Muell. Arg）的遗传转化及植株再生。试验中以来自橡胶树未成熟花药的愈伤组织为转化材料,并通过与含有巴西橡胶树超氧物歧化酶基因（HbSOD）表达载体的根癌农杆菌进行共培养最终获得转基因植株。     

橡胶树次生体胚发生及其再生植株遗传稳定性的分子检测

以热研7-33-97花药为材料,建立橡胶树次生体胚发生和植株再生体系,主要包括初生花药体胚诱导、次生体胚发生和次生胚植株再生三个步骤.结果表明,来自花药初生异常胚和初生子叶期胚的0.2～0.3 cm胚块均能成功诱导次生体胚发生,并均能获得成熟子叶期胚.以初生异常胚为外植体,每个胚块获得子叶期胚数为0.64个.以初生子叶期胚为外植体连续3次诱导次生体胚发生,随诱导次数增加,体胚发生频率先上升,后保持稳定.2,4-D对次生体胚植株再生具有明显影响.添加4.5 μmol/L和9 μmol/L 2,4-D植株再生培养基中植株再生频率达到85.0%.AYLP检测次生体胚植株遗传稳定结果显示:(1)来自初生异常胚的次生体胚植株60.0%植株DNA发生变异;(2)来自初生子叶期胚的次生体胚植株,随次生体胚发生次数增加,检测到DNA变异植株频率由30.0%升高到52.4%.AFLP聚类分析结果显示,次生体胚植株与热研7-33-97高度相似,相似系数大于0.904.     

巴西橡胶树未成熟花药的体细胞胚胎发生及植株再生

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）的未成熟花药为外植体成功实现高频体细胞胚胎发生及植株再生。筛选出的最佳愈伤组织诱导培养基为：改良MS+2,4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L， 最佳体细胞胚胎诱导培养基则为：改良MS+KT 0.7 mg/L+NAA 0.2 mg/L。将成熟体胚转移至无激素培养基中可进一步发育出根、茎、叶完整的小植株。细胞学分析显示， 所有受检小植株均为二倍体。将长至2-3 cm高的小植株移栽到营养袋中并置于温室条件下育苗， 随后可定植到大田。     

橡胶树转基因植株遗传稳定性分析

以GUS染色为阳性的抗性胚状体继代再生植株的叶片为材料,通过PCR分析结合GUS染色对橡胶树转基因植株进行初期的阳性鉴定.结果表明,在59份转基因再生植株中,两对特异引物的PCR扩增结果与GUS染色检测结果一致,其中37株仍然表现为阳性,而22株却检测不到目的基因的存在以及GUS基因的表达,表现为外源基因的丢失.因此,初步推测低选择压造成了早期阳性胚状体在长期的连续继代培养再生植株的过程中发生了外源基因的丢失现象,并结合现有的研究提出了初步的解决措施.     

巴西橡胶树花药体胚发生类型及其培养条件的改良

橡胶树花药培养体胚发生率低及植株再生频率低是制约其组培苗工厂化生产的瓶颈。以热研7-33-97品系花药为外植体,研究橡胶树花药体细胞胚发育过程并对其体细胞胚进行系统分类,同时改良其培养条件。结果表明,完整的体胚发育过程是球形胚-心形胚-鱼雷胚-子叶胚,但有些心形胚不能进一步发育成鱼雷胚,在后继培养中会分化成畸形胚;体胚发生不具同步性,在鱼雷胚旁又长出次生胚。胶树花药体细胞胚共分9种类型,发现胶树花药体胚发生过程中产生连体胚现象,该类胚能正常发育成植株。不同胚状体培养条件对植株再生率的影响说明,暗培养诱导胚状体2个月后再转移至500 lx弱光照条件下培养10～15 d,然后再转移至出苗培养基培养,能够显著提高植株再生率。在诱导胚胎发生培养基中添加不同浓度的稀土,结果表明,稀土具有提高橡胶树花药体胚发生率的效果,其中以添加1 mg/L稀土培养效果最佳。     

橡胶树原生质体培养研究进展

原生质体培养植株再生体系的建立,可为利用生物技术对橡胶树育种进行品种改良提供良好的受体系统.综述橡胶树原生质体培养的研究进展,并分析影响橡胶树原生质体再生的主要因素:(1)原生质体分离的起始材料;(2)原生质体的分离和纯化;(3)培养基成分;(4)培养方法;(5)品种基因型.     

启动子陷阱技术在橡胶树中的应用研究

启动子陷阱技术是克隆未知基因启动子的有效途径。首先用反向无启动子的GUSA替换pCAMBIA-2301载体上的GUSA及启动子序列，构建橡胶树启动子陷阱载体pCAMBIA2301：GUS-NOS，然后转化橡胶树。结果表明：获得了GUS染色阳性胚状体6个，再生后获得2个转基因株系。其中1个株系在胚状体、叶片和根中能检测到GUS基因的强烈表达，另1个株系仅在根中检测到微弱的GUS基因表达，说明获得的转基因植株为不同启动子启动GUS基因的株系。因此通过橡胶树启动子陷阱载体的构建及其在橡胶树中的表达，能够发现和克隆橡胶树内源基因的启动子。     

巴西橡胶树离体材料的绿色荧光背景研究

绿色荧光蛋白GFP是植物遗传转化常用的报告基因,但是有些植物组织由于具有绿色荧光背景而不能使用.为了探索GFP基因作为报告基因在巴西橡胶树遗传转化中利用的可行性,对巴西橡胶树不同的离体材料进行荧光背景检测,发现花药愈伤组织、未授粉胚珠愈伤组织、游离小孢子、花药壁体细胞均能发出极强的绿色荧光,叶片侧脉细胞发出弱的绿色荧光,而叶肉细胞不能发出绿色荧光.这表明橡胶树愈伤组织、游离小孢子、花药壁体细胞、叶片侧脉细胞含有自发荧光物质,在以它们为受体构建转化体系时不能以GFP基因作为报告基因.     

国内外巴西橡胶树替代作物及技术研发现状

天然橡胶是重要的工业原料和战略物资.近年来其供需日趋紧张,而目前大面积商业化种植生产天然橡胶的巴西橡胶树,只能种植在亚洲和非洲等地的热带地区.为此,美国、欧盟的某些机构相继开展了巴西橡胶树替代作物的研究,并在近期取得了重要进展.这对中国及世界其它国家以巴西橡胶树种植为主的天然橡胶产业构成了潜在威胁.为了对目前国内外非巴西橡胶树生产天然橡胶的研究和开发现状进行较为深入系统地了解,本文对国内外巴西橡胶树替代产胶作物及技术开发利用现状进行概括分析,并建议迅速确立专项开展银胶菊及转基因橡胶草等替代巴西橡胶树产胶作物及技术调研研究.     

橡胶的组织培养：过去、现状及未来的展望

摘 要：鉴于以未经选择的实生苗为砧木进行的嫁接繁殖使同一橡胶无性系的不同植株之间在产量及生势方面依然存在相当程度的异质性，故人们迫切希望通过离体微繁途径克服这一难题。在离体微繁中，来自成龄植株及种子实生苗的茎节及茎尖材料均是可供利用的外植体来源。就橡胶无性系的离体微繁而言，所存在的最大问题是难以诱导出具有良好支撑固定作用的直根系，而且外植体对培养基的反应也相对较差。目前，通过离体微型嫁接已使这一问题得到有效改善。近年来，橡胶树体细胞胚胎发生的研究也引起人们越来越多的关注和重视，而且有些基因型已成功诱导体细胞胚胎发生及植株再生。在橡胶树中，至今还没有任何一种组培技术（包括微型扦插及体细胞胚胎发生等）被用于无性系的大规模繁殖。不过，随着研究水平的不断提高，橡胶树的离体微繁殖有望逐步成为现实。