新型Bt杀虫蛋白:VIP杀虫的机理与植物转基因应用

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中最主要是杀虫晶体蛋（insecticidal crystal proteins,ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein,VIP）。VIP在励营养期生长阶段开始分泌,它们不形成蛋白晶体,和ICP在进化上没有同源性。VIP的杀虫活性很高,达到了纳克级水平,为一类新型杀虫蛋白,被认为是第二代生物杀虫剂。VIP根据蛋白质序列同源性主要分为三类：VIP1、VIP2和VIP3。VIP1和VIP2共同构成二元毒素对鞘翅目萤叶甲科昆虫具有特异性毒杀作用,VIP3对鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性。由于VIP对一些可能对ICP产生抗性的害虫具有高效的毒杀作用,而且害虫对ICP和VIP产生交互抗性的几率也很小,因此转VIP植物研究受到了科学家的青睐,并已有不少成功的报道和专利。目前为止,已经利用VIP3构建了转基因水稻、转基因玉米、转基因棉花等多种转基因作物。     

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和PCR技术检测,结果表明:Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、 杂合地整合到转基因植株(T01、 T02、 T03、 T05、 T06、 T07、 T08)的基因组中,并稳定地遗传.ELISA检测表明:在第3～第9叶期Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达,Bt杀虫蛋白的表达量为170～260 ng/25 m     

低温对转Bt基因棉杀虫蛋白表达及其氮代谢的影响

 以2个转Bt基因抗虫棉,泗抗1号（常规种）、泗抗3号（杂交种）为材料,研究了低温对转Bt基因抗虫棉叶片中杀虫蛋白表达量和氮代谢的影响。2007年,于盛蕾期、盛花期、盛铃期,将盆栽棉花18 ℃低温下处理24 h。2008年,在18 ℃低温下处理48 h。研究结果表明,低温胁迫显著降低转Bt基因抗虫棉品种叶片中杀虫蛋白表达量。但盛铃期,下降幅度最大。其中低温胁迫24 h后,泗抗1号下降23.7%,泗抗3号下降28.1%;低温胁迫48 h后,2个品种分别下降52.9%和47.6%。叶片中丙酮酸转氨酶（GPT）活性、游离氨基酸、可溶性蛋白含量与蛋白酶活性在低温胁迫下表现相同趋势。以上结果表明,低温可能导致叶片可溶性蛋白的合成量降低,从而导致杀虫蛋白表达水平的下降。但对可溶性蛋白的分解并未有明显影响。     

转Bt基因棉不同品种杀虫蛋白季节性表达及其对棉铃虫的控制作用

实验室条件下研究了不同品种转Bt基因棉花对棉铃虫抗性的差异、不同生育期棉花抗虫性的变化及Bt毒蛋白季节性表达。结果显示,不同品种转Bt基因棉在不同发育阶段,其棉叶均有阻止棉铃虫取食的作用,表现了明显的抗性,但其抗性强弱存在明显差异。DP 99B抗性表现最好,Hanza154抗性相对较差,6 d平均校正死亡率分别为89.23%和75.91%。转基因棉不同品种对棉铃虫的抗性在时间上呈现动态变化,以植株发育阶段划分,表现为蕾期盛花期花铃期铃期。ELISA测定结果表明,Bt毒蛋白在转基因棉不同器官中的含量差异显著,叶片中Bt毒蛋白的表达量显著大于其它组织器官。随着棉花生长发育的推进,叶片(鲜重)中Bt毒蛋白含量则明显降低,表现为七叶期三叶期蕾期铃期花铃期。     

转Bt基因棉Bt毒蛋白表达量的时空变化

采用抗体夹心ELISA技术,对转Bt基因抗虫棉植株中Bt毒蛋白含量进行了测定.结果表明,Bt基因在所有检测到的器官中均有表达,但是不同器官中的Bt毒蛋白含量明显不同.在苗期全展功能叶中Bt毒蛋白含量最高,根、茎和叶柄中Bt毒蛋白含量较低;在花铃期当日开花的子房中Bt毒蛋白含量较高,雌雄蕊中Bt毒蛋白较低,花瓣及苞叶Bt毒蛋白含量最低.表明Bt基因在不同器官中的表达强度存在差异.不同生育期的功能叶中Bt毒蛋白含量差异显著,Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高,蕾期次之,花铃期最低.随着棉花生长发育进程的推进,Bt基因在叶片中的表达强度逐渐减弱.Bt基因在棉花体内的表达随着器官的不同、生育时期的不同而表现出时空动态变化.这可能是人们所观察到的转Bt基因抗虫棉对棉铃虫抗性呈时空动态变化的根本原因.     

温湿度处理对Bt棉杀虫蛋白表达的影响

 以转Bt基因抗虫棉杂交种泗杂3号为试验材料,在人工气候室内设置4 种温度和湿度组合（高温高湿度、高温低湿度、低温高湿度、低温低湿度）,研究了不同生育期温湿度胁迫及胁迫解除后Bt棉杀虫蛋白表达量的变化。结果表明,温湿度胁迫显著抑制Bt棉杀虫蛋白的表达。同一生育期,高温高湿度下Bt蛋白含量降幅最小,胁迫解除后恢复能力最强;低温低湿度下Bt蛋白含量降幅最大,恢复能力最弱。不同时期温湿度胁迫下Bt蛋白含量降低幅度表现为盛铃期>盛花期>盛蕾期,胁迫解除后Bt蛋白的恢复水平表现出相反的趋势。温湿度胁迫及胁迫解除后Bt蛋白表达量的恢复与胁迫类型、棉花生育期密切相关。     

低温胁迫对Bt棉纤维中杀虫蛋白含量及氮代谢的影响

本研究以常规种泗抗1号(Sikang 1, SK1)和杂交种泗抗3号(Sikang 3, SK3)为材料进行盆栽试验,研究了不同低温水平及其处理持续时间对Bt棉盛铃期纤维中杀虫蛋白含量变化及氮代谢生理特征。结果表明,纤维中的杀虫蛋白含量随着温度的降低总体呈下降趋势,同时低温处理持续期显著影响杀虫蛋白含量。与对照相比,纤维中杀虫蛋白含量的降低幅度随低温胁迫时间的延长而增大。此外,随着处理温度的降低,可溶性蛋白含量、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性呈下降趋势,游离氨基酸含量、肽酶活性、蛋白酶活性呈上升趋势,且在低温处理48 h后,均与杀虫蛋白含量呈极显著相关。因此,低温胁迫促使了蛋白质的合成功能下降,分解能力增强,导致可溶性蛋白含量下降,游离氨基酸含量升高,最终导致杀虫蛋白含量下降,且其受低温胁迫持续期显著影响。     

转Bt基因棉杀虫蛋白含量时空分布及对棉铃虫产生抗性的影响

采用ＥＬＩＳＡ法（酶链免疫法）、室内初孵棉铃虫生测法和田间棉铃虫为害调查方法，研究和分析了中国构建的 Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）基因抗虫棉品系ＧＫ３和美国构建的Ｂｔ基因棉品系新棉３３Ｂ的不同生育期以及花铃期不同器官的杀虫蛋白含量、校正死亡率和田间受害率变化趋势以及它们之间的关系。结果表明，转Ｂｔ基因棉Ｂｔ杀虫蛋白含量在棉花生育过程中呈时空动态变化，在时间分布上，各生育期顶尖平展叶表现为：初花期＞蕾期、花铃期＞苗期＞吐絮期；在花铃期，各器官表现为：功能叶、茎尖＞小蕾、幼铃＞花蕊、花瓣、苞叶、老叶。室内生测幼虫校正死亡率与棉株Ｂｔ杀虫蛋白含量高度一致；田间表现与Ｂｔ杀虫蛋白含量有一定的差异，除主要受Ｂｔ杀虫蛋白影响外，棉铃虫取食选择性，以及残存高龄幼虫为害和棉株各部位营养结构等也影响其抗虫性，造成后期棉铃虫主要为害花、蕾和幼铃，两材料抗虫性表现较为一致。     

印度种植商用转Bt基因棉生物安全性实际评价

本文就转Bt基因棉在印度的种植情况及安全性问题进行了全面论述.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物,孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白。用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗。用CryIA免疫小鼠,经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11。用CryIA(c)多抗包被,B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA,并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量,结果分别为23．4ng·g-1 FW、24．7ng·g-1 FW。     

转Bt基因杂交棉主要性状优势率分布研究

分析了 73个转 Bt基因抗虫杂交组合 F1主要性状的杂种优势及优势率分布 ,认为 :1杂种一代的霜前皮棉产量、株高、铃重、衣分、霜前花率等性状具有明显的正向优势。 2 5 6%的组合霜前皮棉产量竞争优势 ( CH% )集中在 1 0 .1 %～ 35 %之间 ;子棉总产则以 0 .1～ 2 0 %居多 ;铃重、衣分、子指、霜前花率的 CH%主要分布在 0 .1 %～ 1 5 %之间 ;生育期、2 .5 %跨长为负优势 ,多在 - 5 %～ - 0 .1 %之间。 3与 F1相比 ,除子指、2 .5 %跨长外 ,F2主要性状杂种优势均不同程度下降 ,以子棉总产、霜前皮棉产量、霜前花率、单株铃数降幅较大 ;生育期变化较小 ;铃重、衣分、子指虽比 F1有所下降 ,但仍呈现较强的正向优势     

转Bt基因抗虫棉育种策略与效果

应用改进的常规育种技术培育转Ｂｔ基因抗虫棉，可大大提高对鳞翅目害虫的抗性，这是棉花品种改良的新趋势。育种实践表明，根据转Ｂｔ基因种质系供体的特点和遗传缺陷，选择综合性状优良、前期生长势强、株形稍高大松散，铃重较大、生育期相对较短的材料作亲本较为适宜；在杂交技术的应用上，宜采用复合杂交、基因渐渗和有利基因累加技术；杂种后代的处理视杂交方式而定。本文对育种程序中抗虫性鉴定技术进行了讨论。     

抗性棉铃虫在转基因棉花上某些生命参数的研究

用室内转Bt基因棉叶汰选的低抗种群及同源对照种群,测定对田间不同生育期转基因抗虫棉叶及常规棉叶的反应.结果表明,抗性和敏感种群在常规棉叶上,幼虫存活率、化蛹率、幼虫历期及蛹重等指标均无显著差异,但抗性种群的每雌产卵量降低.抗性种群在转基因棉花上存活随棉花不同生育期的变化而出现差异.在7月下旬、8月下旬开始接虫的两代,第10天幼虫存活率,抗性种群比敏感种群提高;而在6月下旬开始接虫,抗性种群与敏感种群一样均不能化蛹,抗性种群化蛹率的提高仅在棉花生长后期(8月下旬开始接虫).比较敏感种群,抗性种群在转基因棉花上幼虫存活率提高,但存活幼虫生长缓慢,幼虫历期延长,蛹重明显减轻.结果表明,低水平抗性种群虽然对转基因棉花有一定适应性,但在转基因棉花上仍然生长发育不正常.     

利用卡那霉素间接鉴定法进行大规模的棉花转基因育种技术

:( 1 )将脱脂棉撕成小条沾取 0 .0 5%的卡那霉素溶液 ,粘附于棉花植株倒 2新生叶上。 5d后所有沾有卡那霉素溶液的感虫棉株的叶片均出现明显的黄色斑块 ,而转 Bt基因抗虫棉的叶片仍为正常绿色 ,无任何症状。 ( 2 )转 Bt基因抗虫棉种子接种于加有 1 0 0 0 mg· l- 1卡那霉素的 MS培养基中。四天后 ,抗虫棉子叶均表现为正常绿色 ,而常规品种子叶全为黄色 ,表明卡那霉素间接鉴定法是鉴定转 Bt基因抗虫棉的简便而又准确的方法     

渍涝与干旱对不同转Bt基因抗虫棉的影响

对 3个转 Bt基因棉花品种的研究表明 ,花铃期田间渍涝显著降低皮棉产量和棉株内的 Bt蛋白含量。积水后棉花主茎功能叶和幼蕾的 Bt蛋白含量平均分别比对照降低 2 7.7%和 2 9.9% ,主茎下部老叶的 Bt蛋白含量仅降低 6 .6 % ,说明渍涝对生长旺盛器官 Bt蛋白合成的影响远远大于衰老器官。干旱对棉株内 Bt蛋白合成的抑制更强 ,当花铃期干旱使棉叶致萎时 ,主茎下部老叶、幼蕾和主茎功能叶的 Bt蛋白含量分别降低了52 .9%、3 7.0 %和 3 0 .0 %。为充分发挥和利用转Bt基因棉花品种的产量与抗虫潜力 ,棉花生长发育的关键时期应尽量避免缺水干旱 ,及时排除田间积水 ,防止渍涝危害     

转Bt基因抗虫棉近等基因系的研究

培育了 7个转 Bt基因抗虫棉近等基因系。Bt基因转入陆地棉基因组后 ,对棉花的衣分、铃重、单株铃数无明显影响 ,对皮棉产量有一定影响 ,部分组合的抗虫植株产量高于感虫植株 ,对绒长、整齐度、比强度、伸长率、麦克隆值等品质指标亦无明显影响。通过回交可将 Bt基因转育到优良品种的遗传背景上 ,实现抗虫性状与高产、优质等性状的结合。     

Bt棉对棉叶螨发生的影响及与次生代谢物质的关系

 为明确Bt棉对棉叶螨发生的影响及其与棉株次生代谢物质的关系,以4个Bt棉品种为材料,以不携带Bt基因的常规棉为对照,在大田和温室中调查了棉叶螨的发生趋势,室内观察了棉叶螨的发育历期,测定了不同品种棉花叶片的棉酚和单宁含量,以及取食不同棉花品种的棉叶螨羧酸酯酶的比活力。结果表明,棉叶螨在4个Bt棉品种上的发生显著重于非Bt棉中棉所12,取食4个Bt棉品种的棉叶螨发育历期均明显短于取食中棉所12的棉叶螨的发育历期。4个抗虫棉品种间棉酚和单宁含量虽有差异,但均显著低于中棉所12,而取食中棉所12的棉叶螨的羧酸酯酶比活力也显著低于4个Bt棉品种。Bt棉本身次生代谢物质含量的改变可能影响了棉叶螨的发生。     

转Bt基因抗虫棉生育特性与经济性状的研究

以转基因抗虫棉Ｒ９３－４等五个品系为材料,对其生育特性有及有关经济性进行了研究。结果表明,Ｒ９３－４,Ｒ９３－６,ＲＨ－４,Ｒ９３－５,Ｒ９３－３等品系与对照相比生育进程提前,早熟,结铃集中,着铃性好,但铃重、衣分较低。转Ｂt基因抗虫棉多表现苗期长势弱,铃小等缺点。     

土壤胁迫与温度对转Bt基因棉抗虫性的影响

土壤水分过多和过少均不利于转 Bt基因棉杀虫蛋白的表达 ,土壤涝渍可造成转 Bt基因棉抗虫性的显著下降 ,而土壤干旱的影响则相对较小。低温 ( 1 8℃ )不仅可明显降低转 Bt基因棉抗虫基因的表达活性 ,亦可明显降低已表达于棉株中的杀虫蛋白的抗虫活性。高温 ( 3 8℃ )亦可降低转 Bt基因棉抗虫基因的表达活性 ,但较低温的影响则相对较小 ;高温下已表达于棉株中的杀虫蛋白对低龄棉铃虫幼虫的抗虫活性明显增强。因此 ,应加强转 Bt基因棉田的水肥管理 ,保证转 Bt基因棉抗虫性的高效表达 ,重视各种异常天气后转 Bt基因棉田间的虫量监测 ,适时进行防治     

种植转双价基因( Bt+CpTI )棉对主要土壤养分和酶活性的影响

 采用灭菌盆栽试验,以转双价棉品种sGK321及其亲本常规棉品种石远321为研究对象,对4个生长时期(苗期、蕾期、花铃期、吐絮期)根际土壤养分(全氮、全磷、速效磷和有机质)含量及某些酶(脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶)活性变化进行了对比分析。结果表明,在观测期间,与同源常规棉相比,转双价棉根际土壤全磷含量和速效磷含量在同一时期均无显著差异,不同生育期差异明显,根际土壤全氮含量、有机质含量、酶活性在一些时期则明显不同,其变化随棉花品种、生育期不同而不同。转双价棉蕾期根际土壤全氮含量和苗期根际土壤过氧化氢酶活性以及苗期、蕾期的碱性磷酸酶活性显著高于常规棉(P<0.05),而蕾期根际土壤有机质含量、根际土壤过氧化氢酶活性和苗期、花铃期根际土壤脲酶活性以及苗期碱性磷酸酶活性则显著低于常规棉(P< 0.05)。聚类分析表明,土壤养分和酶活性变化主要受生长时期的影响,转双价棉种植对其影响是非常有限的。