花生栽培品种转录因子基因DREB1的克隆及表达载体构建

本研究从33个花生栽培品种中克隆获得干旱胁迫响应转录因子基因PNDREB1,经序列分析发现,33个栽培品种PNDREB1的核苷酸序列同源性为100%,并构建了植物表达载体p GBDREB1,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

花生CEM1基因的克隆及表达载体构建

通过规模测序和生物信息学分析,从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADSbox家族的一个cDNA全长序列,命名为CEM1基因(GenBank登录号为EY396043)。该基因全长1 061 bp,包含762 bp的开放阅读框,编码253个氨基酸,蛋白质的分子量为29.405 ku,等电点(pI)为9.18。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明,该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小,具有亲水性。同时构建CEM1基因的VIGS表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大白菜GID1家族基因鉴定及表达模式分析

GID1蛋白是赤霉素信号转导过程中的重要受体,在调控植物生长发育过程中发挥重要作用。本研究采用生物信息学分析方法对大白菜基因组中GID1家族基因进行鉴定,并对该基因结构、染色体分布、系统进化以及表达模式等进行分析。结果表明,大白菜基因组中含有5个GID1家族成员,分别位于4、5、6、7、9号染色体上,各成员都只含有1个内含子。系统进化结果显示,单子叶和双子叶植物的GID1蛋白明显处于两个不同分支,大白菜GID1家族成员与拟南芥GID1具有更近的亲缘关系。通过表达模式以及启动子顺式响应元件分析发现,大白菜GID1基因不仅参与生长发育调控还可能参与对不同环境因子的响应过程。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的cDNA片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码PEPCase基因的cDNA片段(886 bp),测序结果显示其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%、84.37%、81.54%、81.25%、78.71%.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

花生生长素响应因子基因AhARF3的克隆与表达分析

生长素响应因子(auxin response factor, ARF)是调控生长素响应基因表达和信号转导的一类转录因子,在植物生长发育的各个阶段均起重要的调节作用。本研究基于花生种子萌发前后转录表达差异分析,克隆到1个生长素响应因子基因AhARF3。序列分析结果显示,该基因的ORF区为2 115 bp,编码704个氨基酸,推测相对分子量为72.92 kD,等电点6.86。不同器官表达谱分析结果显示,AhARF3为组成性表达,茎中的表达量最高,根与花中的表达量较低且近似,干种子中最低。种子萌发过程的表达分析显示,萌发10～72 h的种子中AhARF3表达量均比干种子中极显著增加,尤其是萌发48～72 h,AhARF3的表达水平不仅比萌发前期各阶段种子中的大幅上调,与根、茎、叶、花及各发育阶段的种子相比,也具有明显的表达优势。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

大白菜PAT1基因的克隆及其表达载体的构建

根据GenBank中大白菜（Brassica campestris L ssp．pekinensis）基因组测序结果,分析了大白菜PAT1（phytochrome A sjgnal transduction）基因的内含子和外显子。通过拼接外显子,获得了大白菜PAT1基因的cDNA编码序列。根据编码区序列,设计并合成了一对引物;利用这对引物,采用RT—PCR技术扩增出大白菜福山包头PAT1基因（CcPAT1）的全长cDNA序列。CcPATl编码区共1500bp,与拟南芥PAT1相似性为85．03％。同时构建了含有35S启动子的pCAMBIA-2300-CcPAT1过表达载体,并利用以PAT1 5’端特异区域构建了pFGC-1008-PAT1RNAi（RNA interference）载体,以备将来研究大白菜CcPAT1基因的功能。     

小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

[目的]发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制,为小麦抗逆育种提供新的基因资源。[方法]利用PCR技术克隆小麦TVP1基因,扩增获得cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。[结果]小麦TVP1基因全长2 289 bp,编码762个氨基酸;其氨基酸序列具有12个跨膜结构,该结构中疏水氨基酸具有高度保守性,且肽链N末端与C末端均位于膜外,预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白,推测与其具有的H⁺离子泵通道功能密切相关;系统发育树分析表明,TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高,该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR分析表明,小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中,具有组织特异性,且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异,这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。[结论]克隆并分析了小麦TaTVP1基因,为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。     

花生种皮中一种NBS类抗病基因的克隆与序列分析

利用植物抗病基因核苷酸结合位点（NBS）的保守区设计一对特异引物,以抗、感黄曲霉病花生品种J11和金花1012的种皮基因组DNA和RNA为材料进行DNA-PCR和RT-PCR扩增,经克隆、测序,得到一条504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登录号为GQ199610。Blast和Blastx分析发现pnbs1核苷酸序列与C8V1G10F抗性蛋白的核苷酸序列的同源性为89%,与抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性为59%。该片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS区域的3个保守模体：GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推测pnbs1可能是花生NBS类抗性基因的核心区域。     

枣树花分生组织特异基因ZjAP1的克隆与表达分析

以枣树(Ziziphus jujuba Mill)为试材,通过反转录RT-PCR和快速扩增cDNA末端的方法,从花萼片组织中克隆获得一个花分生组织特异性基因的全长序列(SQUA/AP1同源基因),命名为ZjAP1(GenBank登录号:EU916199)。生物信息学分析ZjAP1cDNA序列的开放阅读框长度为738bp,编码245个氨基酸,保守域含有SQUA/AP1家族典型的MADS盒蛋白、K盒结构域。ZjAP1的氨基酸序列与其他植物SQUA/AP1具有很高的相似性,进化树分析表明,ZjAP1和其他物种的AP1起源于相同的祖先。半定量RT-PCR分析表明,ZjAP1在花芽、花蕾、花、幼果中都有表达,在结果枝中整个花发育过程中一直有表达,在营养枝和膨大的果实及种仁组织中没有表达,说明ZjAP1与花发育的调控有关。     

甘薯Ran基因的克隆和表达分析

Ran蛋白是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白和RNA分子的运输过程。研究发现有些Ran基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得甘薯Ran基因,本试验通过RT-PCR克隆了1个甘薯Ran基因。测序结果显示其含有长666 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含221个氨基酸,推测分子量为25.15 kDa。比对分析发现甘薯与多种生物的Ran蛋白的氨基酸序列同源性都超过90%,荧光定量PCR研究表明IbRan基因受低温、PEG、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控甘薯的抗逆性奠定了基础。     

薄荷GPPS基因的克隆与表达分析

牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。     

北京鸭MC4R基因的克隆及其组织表达的差异

黑素皮质素受体-4(melanocortin receptor-4,MC4R)是黑素皮质素受体家族5个亚型(MCR1-5)之一,在控制食欲、体质量、能量平衡中有重要作用。本研究采用RT-PCR技术从北京鸭脑组织中克隆出鸭MC4R基因的编码区序列,分析其基因结构并进行功能预测,利用实时荧光定量进行组织差异表达研究。结果表明,鸭MC4R基因编码区全长996 bp,编码332个氨基酸,包括起始密码子ATG和终止密码子TAG;与鹅、鸡、小鼠、人的相似性分别为97%、95%、78%、80%;推导的氨基酸序列显示,鸭MC4R蛋白具有G蛋白耦联受体家族结构域;实时定量结果表明,MC4R基因在北京鸭各组织相对表达水平存在差异,其中在脑组织中表达最高,脾脏、心脏、腿肌、腹脂、肾脏次之,而在肝脏和肺脏中表达量最低。本试验为进一步研究鸭MC4R基因的生物学功能奠定了基础。     

盐穗木Hc2a1基因的克隆及与表达分析

[目的]盐胁迫能够抑制植物生长.探讨盐穗木(Halostachys caspica)盐胁迫响应基因表达变化的影响,有助于阐明盐穗木的耐盐分子机理.[方法]利用RACE方法获得盐穗木Hc2a1基因全长序列,并进行生物信息学分析和基因表达检测.[结果]Hc2a1基因开放阅读框为2 277 bp,编码758个氨基酸,蛋白质分子量为87.29 KDa,理论等电点(pI)为9.32.亚细胞定位于线粒体内膜,具有一个16个氨基酸的信号肽,含多个跨膜结构域,亲水性氨基酸残基多于疏水性氨基酸残基,二级结构多为无规则卷曲.利用荧光定量PCR检测显示,在高盐浓度600 mmol/L处理不同时间条件下,随着盐胁迫时间的延长,Hc2a1的表达量逐渐上升,12h达到最高峰,随后开始下降.[结论]盐穗木Hc2a1基因编码多个C2结构域和跨膜区的蛋白质,基因表达受盐胁迫的诱导.     

AOS1 基因克隆及其在鲜切芋头褐变中的表达模式分析

【目的】鲜切芋头即使在低温条件下贮藏,贮藏期间仍会出现变黄变褐的现象,严重影响鲜切芋头的商品性。从鲜切芋头中克隆丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase, AOS）基因 AOS1,并分析其表达与鲜切芋头褐变的关系,鉴定鲜切芋头褐变过程中的重要功能基因,为鲜切芋头褐变机制研究提供参考。【方法】以鲜切芋头 cDNA 为模板,采用 RT-PCR 法克隆 AOS1 基因编码序列（Coding sequence, CDS）;采用荧光定量 PCR 法分析鲜切芋头褐变过程中 AOS1 表达情况,利用转录组测序数据分析外源褐变抑制剂处理对 AOS1表达的影响,并分析 AOS1 启动子序列。【结果】20 ℃条件下,鲜切芋头贮藏 24 h 切面出现明显的变黄变褐症状,而 4 ℃下贮藏 12 d 才出现明显的褐变症状,表明贮藏温度是影响鲜切芋头褐变进程的重要因素,低温贮藏可有效抑制鲜切芋头褐变。芋头 AOS1 基因的 CDS 全长为 1 560 bp,编码 519 个氨基酸残基;AOS1 基因编码蛋白质的分子量为 57.63 kD,等电点为 8.68,定位在叶绿体。植物 AOS1 蛋白序列相似性较低,芋头 AOS1 与番茄AOS1、拟南芥 AOS1 蛋白的亲缘较远,但天南星科植物 AOS1 蛋白的序列同源性较高。芋头 AOS1 启动子中含有许多植物激素和逆境响应元件,AOS1 表达在鲜切处理后显著上调,表明切分处理诱导了 AOS1 的表达。随着鲜切芋头褐变进展,AOS1 表达量逐渐增加,外源乙醇酸和香草酸处理 AOS1 表达显著下调,表明 AOS1 表达与鲜切芋头褐变有关。【结论】鲜切芋头褐变与 AOS1 表达具有明显正相关性,切分去皮等处理可能通过诱导 AOS1表达促进鲜切芋头褐变。     

小麦水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用,采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得 TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp,共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域,为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达,在茎中表达量最高。在PEG胁迫下,该基因的表达量下调,表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H₂O₂胁迫下,表达量先下调后上调,推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。