嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AopN蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株Ⅲ型分泌系统aopN基因序列,设计1对特异性引物,以J-1株的基因组为模板,PCR扩增得到aopN基因,连入pET-32a(+),转化至大肠杆菌表达,同时PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。aopN基因测序分析发现,片段长度为874 bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能检测到aopN基因的目的片段。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量为54.5ku,用兔抗J-1株的全菌抗血清进行Western blot分析表明,该蛋白具有较好的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株AH－78－2气溶素（Aer）基因保守区的测序结果，设计2对引物，建立了检测嗜水气单胸菌的PCR方法，通过对20株嗜水气单胞菌，12株相关菌株及157份送检病料的检测，并与SPA－CoA检测结果对照表明，PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可检测最低100cfu的细菌，该方法的建立为致病性嗜水气单胸菌的检测提供了一种简便，快速的新途径，以我国分离株的序列设计引物使该法具有更强的针对性。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析.结果表明:...     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

嗜水气单胞菌HEC毒素基因的克隆及酶谱分析

嗜水气单胞菌ＨＥＣ毒素是该菌重要的致病因子和保护性抗原。为了解其分子生物学特性，用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取了嗜水气单胞菌Ｊ－１株的染色体，经ＥｃｏＲＩ酶切、琼脂糖凝胶电泳后作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，用ＤＩＧ标记的ＨＥＣ毒素探针检测，其５．０ｋｂ的酶切片段呈阳性。回收该片段，与ｐＵＣ１９相连，转化大肠杆菌ＪＭ１０９。提取Ｘ－ｇａｌ平板上白色菌落的质粒，经大小比较、ＥｃｏＲＩ酶切分析及ＤＩＧ标记ＨＥＣ毒素核酸探针斑点杂交鉴定，获得ｐＨＥＣ１１等含５．０ｋｂ目的ＤＮＡ片段的重组质粒。ｐＨＥＣ１１质粒经酶切、电泳，证实目的ＤＮＡ片段中含有ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＰｓｔⅠ及ＰｖｕⅡ等酶切位点，并绘制了其物理图谱。同时还构建了若干亚克隆，为研制嗜水气单胞菌基因工程苗提供了目的基因片段。     

林蛙源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析

对林蛙源嗜水气单胞菌β-溶血素基因与AHL316HEM进行序列和结构分析表明,目的基因读码框架全长为1482bp,编码长度为493个氨基酸的蛋白,分子量为54.2kD,从起始位点至第23个氨基酸残基形成明显疏水区,可能构成信号肽。同源性分析表明,AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与林蛙源嗜水气单胞菌溶血素基因的同源率为99.7%,表明俩者可能有共同的起源。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因的生物信息学分析

根据嗜水气单胞菌的溶血素(Hly A)、外膜蛋白(Omps)及丝氨酸蛋白酶(Ahp A)基因,分别设计3对特异性引物。通过3重PCR法对三对基因进行克隆与生物信息学分析。溶血素、外膜蛋白及丝氨酸蛋白酶基因的开放阅读框分别为1 863 bp、1 071 bp及894 bp,分别编码621、357及298个氨基酸。同时,对其氨基酸序列进行系统进化树构建、蛋白理化性质分析、蛋白信号区域和结构区域分析、蛋白二级结构预测、蛋白三级结构预测及蛋白免疫原性分析。本研究对大鲵源致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因进行生物信息学分析,为进一步研究嗜水气单胞菌保护性抗原多样性而提供理论基础。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达

根据 Gen Bank中致病性嗜水气单胞菌气溶素 (Aer)基因的序列设计引物 ,以国内嗜水气单胞菌分离株为模板 ,扩增出 Aer基因的全长序列。经 T载体克隆和序列测定 ,证实克隆了国内分离株的不含信号肽的 Aer全长基因。将该基因以正确的读码框架与表达载体 p ET2 8b连接 ,经 IPTG诱导、SDS- PAGE检测 ,外源基因获得高效表达。诱导 4 h的培养物中 ,融合蛋白的表达占菌体总蛋白含量的 4 8.5 7%。 Western-印迹结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌产生的天然毒素 ,而且天然毒素制备的抗体也能识别纯化的重组毒素     

嗜水气单胞菌不同分离株生化特性及胞外蛋白酶的检测

嗜水气单胞菌可引起多种宿主患病,该菌致病性与其产生的多种毒力因子特别是胞外蛋白酶有关。本研究检测了26株嗜水气单胞菌不同分离株的生化指标,采用脱脂乳平板法检测了胞外蛋白酶的产生情况,并利用PCR技术检测了2种胞外蛋白酶基因ahp-A(编码丝氨酸胞外蛋白酶)和eprCAI(编码温敏胞外蛋白酶)。结果表明,大部分菌株生化指标表现为蔗糖(+)、阿拉伯糖(+)、葡萄糖(+)、甘露醇(+)、鸟氨酸脱羧酶(-)、肌醇(-)、七叶苷(+);脱脂乳平板法检测发现,91.7%(22/24)的致病菌株均能产生胞外蛋白酶,而2株无毒株则不能产生,对2个胞外蛋白酶基因的检测也得到相似的结果。本研究将为嗜水气单胞菌的流行病学调查和致病机制的深入研究奠定基础。     

林蛙嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆、分析及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用PCR方法,扩增出与预期设计的740 bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为740 bp,共编码246个氨基酸.该基因片段与已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列同源性为98.78%,氨基酸同源性为98.78%.利用生物信息学和分子生物学软件,对嗜水气单胞菌外膜蛋白的结构进行预测,结果表明其为外膜孔蛋白.本试验为嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

乌鳢致病嗜水气单胞菌的分离与毒力基因检测及耐药分析

为鉴定南方某水产养殖基地因肠道肠炎及腹水致死乌鳢的致病菌,从患病乌鳢组织中分离得到一株优势菌株,经人工感染试验鉴定该病菌有较强的致病性,能致乌鳢、小鼠及斑马鱼患病死亡,进行形态学、理化特性分析,初步判定该菌隶属于气单胞菌属。进一步采用分子生物学方法,进行16S rDNA和管家基因序列测序,系统发育树分析,并对该菌的耐药性及毒力基因携带情况进行分析。结果表明：在16S rDNA及管家基因系统发育树上,该菌与嗜水气单胞菌聚类,且同源性高达99.1%。毒力基因检测出该W12菌株含有黏附素(aha)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、脂肪酶(Lip)、细胞毒性肠毒素(act)、气溶素(aer)、核酸酶(exu)及密度感应系统调控基因(LuxS)7种毒力因子。细菌载量试验结果表明：在血液中亦能检测到细菌,表明该株A.hydrophia能导致菌血症,致病力较强;同时在肝脏和肾脏中细菌载量最高,其可能是细菌的主要攻击器官。药敏试验结果表明：该菌对头孢氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、呋喃妥因、诺氟沙星、氨苄西林、多西环素及青霉素8种药物高度敏感。毒力基因以及脏器细菌载量试验为后续药物治疗提供有效靶点,药敏试验为生产应用中的快速治疗提供科学依据。     

嗜水气单胞菌胞外产物的生物活性及主要蛋白型分析

在血清学分型的基础上制备了23 株嗜水气单胞菌和1 株温和气单胞菌的胞外产物。分析这些菌株的溶血活性、蛋白酶解活性和细胞毒活性。结果表明,上述3 种生物学活性与菌株血清型间没有严格的对应关系。SDS PAGE分析显示,胞外产物的SDS PAGE图谱主要包括35 ku,45 ku,53 ku 3个主要蛋白质条带。有别于此前的多数报道,35 ku的蛋白质条带为多数菌株(22/24)所共有。根据凝胶上主要蛋白条带在不同菌株中的分布,可初步将其中的18 株细菌分为3 个胞外产物ECPs蛋白型,该ECPs蛋白型显示与血清型有一定的对应关系。经蛋白酶K消化处理的ECPs,银染可见脂多糖(LPSs)的典型O 糖侧链结构,显示脂多糖是组成粗制ECPs的重要组分之一。     

嗜水气单胞菌fla基因重组植物乳杆菌的构建及其表达产物的免疫原性分析

为了检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)鞭毛(flagellum, fla)基因在重组植物乳杆菌中表达产物的免疫原性,试验将目的基因fla与表达载体pPG结合,通过电击法将其转至植物乳杆菌感受态细胞中,构建重组植物乳杆菌Lp-pPG-fla,通过Western-blot检测重组植物乳杆菌fla蛋白的表达情况。将120尾鲫鱼随机分为Lp-pPG-fla组、Lp-pPG组和PBS组,各组分别连续口服Lp-pPG-fla、Lp-pPG和PBS 28 d,分别在0(免疫前)及开始免疫后第7,14,21,28天时采集血清,通过ELISA试剂盒检测血清中免疫球蛋白(Ig)M的含量,溶菌酶(LYS)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在第29天(口服结束后第1天)进行免疫保护性试验,观察2周并记录死亡情况,计算免疫保护率。结果表明：成功构建了重组植物乳杆菌Lp-pPG-fla,获得的fla蛋白条带大小为38 ku。免疫后Lp-pPG-fla组鲫鱼血清中IgM含量在7,14,21,28天极显著高于其他两组(P<0.01),Lp-pPG组和PBS组之间差...     

猪大肠杆菌与嗜水气单胞杆菌混合感染病例的诊断及其体外抑菌试验

南昌某猪场仔猪大量死亡,为了查明病因,找到防控的有效办法,对死亡仔猪病变部位进行细菌分离培养,得到分离菌Z-d-1、Q-d-1、Q-d-2,用常规法对3株分离菌进行生化鉴定、药敏试验、致病性试验、体外抑菌试验。结果:Z-d-1与大肠杆菌的生化特性一致;Q-d-1、Q-d-2与气单胞杆菌生化特性一致;3株分离菌对大部分抗生素耐药,对丁胺卡那、呋喃唑酮均高敏;攻毒小白鼠24 h均死亡;乳酸菌对其均有较好的抑制作用。结论:分离菌Z-d-1为大肠杆菌,Q-d-1、Q-d-2为嗜水气单胞杆菌;该病为大肠杆菌与嗜水气单胞杆菌混合感染所致;乳酸菌可取代或部分取代抗生素对该病的防治。     

嗜温气单胞菌的鉴定及其外膜蛋白型研究

从病鳖、鳗鱼体内分离到2株嗜温气单胞菌(TAh-3、EAs-1),经形态学观察、生理生化特性等鉴定,确定TAh-3为嗜水气单胞菌,EAs-1为温和气单胞菌。动物感染试验结果表明,TAh-3株为致病性嗜水气单胞菌,对鲫鱼的致死率100%,EAs-1株为非致病性温和气单胞菌。SDS-PAGE电泳结果显示,TAh-3株外膜蛋白(OMPs)型由7条蛋白带组成,其中1条主带大小为40.0kDa;EAs-1株OMPs型由8条蛋白带组成,其中2条主带大小为38.0kDa、45.0kDa。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎(IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒(NIBV)W株；再通过SPF鸡胚连续传代，获得了NIBV疫苗毒株W93；继而借助RT—PCR法扩增了其S1基因，并测定了S1基因的核苷酸序列，分析了与相关毒株间的同源性。结果显示，W93株在鸡胚中的病毒产量达107.8EID50／0.1mL，适用于所有日龄的雏鸡；W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M41株、H52株和H120株的同源性很高，分别为96．9％、96．8％和97．1％。表明，W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株。     

鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98-1株F基因全序列的克隆和序列分析

本研究报道了PMV－1／鸽／肇庆／1／1998株（ZQ98－1）F基因的全序列。该基因核苷酸序列长度为1712bp,编码由553个氨基酸组成的F0多肽。F0蛋白裂解位点处的氨基酸序列为^112K-R-Q-K-R-F^117,F0蛋白中有3个与病毒副合相关的重要抗原位点和6个糖基化位点。经比较,鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98－1株和PMV－1／Pigeon/England/1168/84(1168/84)株、Warwick株及Ulster株核苷酸序列的同源性分别为95％、90％和89％,氨基酸的为异率分别为5．4％、6．2％及9．1％。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒W93疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了两对引物并以RT－PCR特异性扩增出嗜肾型IBV W93疫苗株的S1基因，基因产物大小为1.62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与标准毒株H52、H120、M41、BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，W93株与H52、H120、M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为96．8％、97．1％、96．9％和96．8％，由此可以看出嗜肾型IBV W93疫苗株与标准毒株在S1基因上具有高度的同源性。     

基因Ⅶ型NDV强毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析

运用一步法RT-PCR扩增两株高致病力NDV分离株的F基因重要功能区,并进行序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点氨基酸顺序均为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符,且具有101位的K(赖氨酸)和121位V(缬氨酸)两个特征性氨基酸,与基因Ⅶ型NDV的特征完全相符[1]。与疫苗株lasota进行序列比较,并构建了系统发育树,结果表明两株病毒核苷酸同源性达96.6%,与lasota同源性为63.7%,从分子水平揭示了这两个毒株抗原性与常用疫苗株Lasota差异较大的原因。     

牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

扩增大庆地区分离的牛副流感病毒3型的N基因,并进行同源性分析。设计特异性引物,通过聚合酶链反应扩增牛副流感3型N基因,将该基因分别连接到克隆载体的BamHⅠ、HindⅢ酶切位点中,测定插入片段的核苷酸序列,并利用分子生物学软件进行同源性分析。序列分析结果表明,扩增获得BPIV-3-N基因全长1 548bp,编码515个氨基酸,该N段基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中日本分离株910N基因序列同源性较高,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。