家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种的中肠组织蛋白比较分析

为了探明家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种间在分子机制上的差异,通过蛋白质双向电泳(2-DE)和基质辅助质量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对两个不同抗性家蚕品种的中肠组织蛋白进行了比较分析。2-DE电泳结果表明,两个品种间的中肠组织蛋白斑点数及位置、形态等差异很小,进一步比较获得了9个差异蛋白斑点,其中感受性蚕品种JS有6个,抵抗性蚕品种NIL有3个。经MALDI-TOF MS鉴定结果显示,感受性品种JS有4个差异蛋白斑点可能分别为氢离子转运ATP合酶β亚基1、氢离子转运ATP合酶β亚基2、组织蛋白酶D或3-羟酰辅酶A脱氢酶;抵抗性品种NIL中有2个差异蛋白点可能是组织蛋白酶。     

家蚕对浓核病毒中国(镇江)株抵抗性机制的初步研究

通过生物测定和地高辛(DIG)标记的酶联免疫吸附剂测定(ELISA),初步分析了家蚕对浓核病毒中国(镇江)株(Bombyxmori densovirus,BmDNV-z)的抵抗性机制。试验表明:供试家蚕品种的消化液、血液中均不存在对BmDNV-z侵染性有影响的蛋白因子;抵抗性家蚕品种的中肠组织蛋白中不存在BmDNV-z的病毒受体蛋白,而感受性家蚕品种的中肠组织蛋白中可能存在对BmDNV-z侵染性有影响的蛋白因子,即感受性家蚕品种的中肠组织中可能存在BmDNV-z的病毒受体蛋白因子,且BmDNV-z与感受性家蚕品种中肠组织蛋白的结合具有组织特异性。     

家蚕浓核病毒“镇江株”基因文库的构建

家蚕DNV—DNA经限制性内切酶Sau3A部分酶解,与经BamHI酶解后的载体PWR13连接,转化E·coli,通过遗传标记筛选、酶解电泳分析,证明BmDNV基因组的绝大部分已被克隆.     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株基因组的克隆及重组质粒转染家蚕对浓核病毒的拯救

家蚕浓核病毒中国(镇江)株(BombyxmoriDensovirus Zhenjiang Strain,BmDNV-ZJ)包含VD1和VD2共2种基因组DNA。以BmDNV-ZJ感染家蚕中肠总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到2种DNA,并将其克隆到质粒pGEM-T构建了重组质粒pGEM-VD1和pGEM-VD2。采用DEAE-dextran转染技术,将2种重组质粒分别导入家蚕幼虫体内,能使家蚕幼虫发病,免疫双向扩散和免疫酶组化法检测都能检出阳性反应,但转染pGEM-VD2重组质粒的家蚕幼虫发病率较低。通过重组质粒转染方法,可以使BmDNV-ZJ感受性品种和抵抗性品种都发病,但感受性品种的发病率较高。将重组质粒转染发病蚕的中肠匀浆,取上清液经口接种健康蚕幼虫,也能使其发病。上述结果表明,携带BmDNV-ZJ DNA的重组质粒在家蚕幼虫体内拯救出了感染性的病毒粒子。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

分析了家蚕在变态期不同发育时段中肠组织蛋白表达差异的信息。SDS-PAGE电泳分析显示,从家蚕吐丝前1 d到化蛹72 h的中肠蛋白分离到相对明显的16条泳带,其中分子量约为30、45、70 kD的蛋白组分含量较大,且比较稳定,分子量约为50、60、62 kD的蛋白组分在不同时期存在着显著的表达差异。进而通过聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析,发现家蚕中肠组织蛋白的表达种类和差异蛋白数目的变化在化蛹1～3 d非常明显:蛋白表达种类的变化呈现2个高峰,分别为化蛹0 h和化蛹41 h;差异蛋白数目的变化呈现3个波峰,分别在吐丝98 h至化蛹0 h、化蛹30～41 h和化蛹41～58 h。在化蛹1～3 d,这种显著峰值变化的时期刚好与家蚕中肠组织发生旧肠壁细胞退化死亡和新生肠壁细胞分化增殖的盛期相吻合,从一个侧面反映了家蚕中肠组织在变态期活跃的发育进程。     

微粒子病家蚕中肠组织蛋白质的变化

用浓度为104spores/mL、106spores/mL和108spores/mL的家蚕微孢子虫孢子2mL分别感染三组4龄起蚕(每组100条),另设一组作为空白对照。分别于5龄起蚕饷食后第48h、96h和144h解剖获取中肠组织,提取中肠组织蛋白质进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结果显示感染后的不同时间,家蚕中肠组织蛋白质出现了不同的变化,并且某些蛋白的变化与感染的浓度呈相关性     

感染二分浓核病毒家蚕相关MicroRNA的筛选与鉴定

二分浓核病毒(bidensovirus,BDV)是家蚕病毒病的主要病原之一。为了筛选和鉴定家蚕体内与BDV感染相关的差异表达microRNA(miRNA),对家蚕品种JS的3龄起蚕添食BDV,36 h后收集家蚕并提取总RNA,采用高通量测序技术分析家蚕感染BDV后应答的miRNA,从中筛选出24个显著差异表达的miRNA,其中14个为已知miRNA,10个为新发现的miRNA。进一步利用反转录PCR(RT-PCR)技术对上述24个miRNA进行验证,发现这些miRNA均在家蚕幼虫体内表达;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测家蚕感染BDV后这些miRNA的表达情况,发现其中9个miRNA表达上调,15个miRNA表达下调,其中表达上调倍数最高的为bmo-miR-1923,相对表达上调了8.87倍,表达下调倍数最高的为bmo-miR-13b-3p,相对表达下调了6.97倍。此外,根据测序结果进行生物信息学预测和分析差异表达miRNA的靶基因,并利用GO分析对靶基因进行功能分类,发现这些靶基因主要参与了细胞过程、催化、结合和代谢过程。研究结果将为阐明家蚕抗BDV的分子机制提供数据参考和技术支持。     

关于高低温处理蚕对家蚕浓核病毒(DNV)敏感机制的研究

五龄蚕经高、低温冲击一定时间后,蚕体中肠组织发生病变,中肠细胞发现坏死,肠壁折皱减少,单位细胞密度下降,并且,中肠的各种细胞类型比例发生变化,园筒型细胞明显减少。冲击后的蚕经室温条件8小时后,园筒型细胞数呈上升趋势。Bm-DNV 感染冲击后的蚕,恰是中肠为修复被损细胞而大量增殖新细胞的时期,因这些新生细胞对病毒最敏感,所以最终表现为大量发病。中肠组织的糖元含量与其所处的环境有关,糖元参与了蚕的中肠组织的修复和细胞再生等过程。     

家蚕中肠组织蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的中肠组织进行了研究,利用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,并采用GPMAW软件对家蚕基因组预测的蛋白质数据库进行了本地构库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。结果发现,家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和图像分析,银染后可以检测出600个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量15～80 kD区域,等电点3～8.5之间。MALD I-TOF MS鉴定的36个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中32个蛋白点得到了成功鉴定,包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等。这一结果为进一步认识家蚕中肠组织的生理功能提供了基础信息。     

家蚕5龄第3天血液蛋白的双向电泳及质谱分析

基于为家蚕血液比较蛋白质组学的研究提供基础信息的目的,利用双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的血液蛋白进行分析,并采用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对其中一些表达量较高的蛋白进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。120μg血液蛋白经过双向凝胶电泳及考马斯亮蓝染色后可以检测出106个蛋白点,60μg血液蛋白经双向电泳及银染后可以检测出126个蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子质量15~80 kD区域,等电点4~7。MALD I-TOF MS鉴定的52个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中成功鉴定了46个蛋白点。在这些蛋白中,不仅包含了SP贮存蛋白和30 K低分子量脂蛋白等家蚕血液蛋白的主要成分,还包含了大量与代谢相关的蛋白酶类、蛋白酶抑制剂、离子转运蛋白、免疫相关因子、分子伴侣等不同种类的蛋白。     

家蚕脂肪体合成蛋白质变化的研究

应用双向电泳、同位素标记、放射自显影及计算机蛋白质电泳图谱分析技术研究了家蚕 5龄期和变态期脂肪体合成蛋白质的变化。结果表明 ,在 5龄中期脂肪体合成蛋白质的种类、分泌蛋白质的量、合成蛋白质的速度都达到最大值 ,合成脂肪体组织蛋白质在 5龄中期也快速增加 ,显示在 5龄中期脂肪体的蛋白质合成水平达到最大值 ,而熟蚕期后脂肪体合成蛋白质种类、分泌量及合成速度都下降 ,表明脂肪体蛋白质合成水平下降 ,在蛋白质合成水平上证明了家蚕脂肪体从幼虫期的合成、代谢等主要功能向变态期的贮藏功能转变。     

家蚕孤雌生殖系与有性生殖系亲本的血液比较蛋白质组学研究

为进一步解析家蚕孤雌生殖的发生机制,采用双向电泳(2-DE)、基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)和生物信息学技术,对高发生率和高孵化率的家蚕孤雌生殖系与其有性生殖系亲本的血液蛋白质组成进行比较分析。较其有性生殖系亲本,孤雌生殖系幼虫在5龄第3天、第5天和第7天血液中的差异蛋白不完全相同。对6个持续表达和差异明显的蛋白进行质谱分析,成功鉴定其中2个蛋白分别是保幼激素结合蛋白和胰凝乳蛋白酶抑制剂-8A,推测这2个蛋白及其余4个未被鉴定出的蛋白与2种生殖方式家蚕品系的生长发育、生殖等过程的调节有关联。