鸭出血症病毒间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立快速检测鸭出血症病毒(DHDV)的血清学方法,本试验利用浓缩纯化的DHDV作为包被抗原,建立了检测DHDV血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。试验结果表明,抗原最佳稀释浓度为7.06 μg/孔;最佳包被条件为37 ℃ 1 h后,4 ℃包被过夜;待检血清的最佳稀释倍数为1:25。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.44。建立的ELISA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、雏番鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒阳性血清均无交叉反应,结果表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的最大变异系数分别为0.0221、0.0032,显示该方法具有很好的稳定性,与血清中和试验的符合率为100%。该方法快速、简单、特异性好、重复性好,可用于大批量监测鸭群DHDV血清抗体感染情况。     

阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。     

鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的初步应用

为了开发鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,研究利用灭活纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)FX2010株作为包被抗原,由瑞普(保定)生物药业有限公司连续制备了5批次鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中试产品。该试剂盒对禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒阳性血清和5份SPF阴性质控血清进行的检测均无交叉反应,表明具有较好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数为1.5%~4.2%和2.2%~5.3%,表明产品具有很好的稳定性。应用该试剂盒及中和试验对300份疑似DTMUV阳性血清样品进行检测,结果显示:二者阳性样品符合率为90.12%,阴性样品符合率为93.6%,总符合率为92.7%。研究结果表明,该试剂盒具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可以为鸭坦布苏病毒病的快速诊断及其流行病学调查提供有力的工具。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用

为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。     

鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用

本研究以鸭病毒性肠炎(DVE)病毒作为包被抗原,建立了检测DVE抗体的间接ELISA诊断方法.应用该ELISA诊断方法检测DVE阳性对照血清,当血清稀释至12800 倍时,结果仍为阳性;检测其它7种鸭病阳性血清结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于10%;该检测方法与血清中和试验的符合率为100%.DVE 活疫苗皮下免疫鸭抗体监测结果表明:鸭免疫后第7d 可以在血清中检测出DVE特异性抗体.本试验建立的诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DVE免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)抗体的方法,本研究以纯化的重组σC蛋白作为包被抗原,并对该方法的反应条件进行优化,建立了NDRV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对NDRV血清检测为阳性,与番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭源鹅细小病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。其批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。利用建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测,结果显示与NDRV全病毒间接ELISA的符合率为88.75%。本研究建立的ELISA方法为NDRV的流行病学调查提供了快速、特异的血清学检测方法。     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1：2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%~9.47%,批间变异系数为2.43%~14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。     

基因C型鸭甲肝病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为建立基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)间接免疫荧光检测技术(IFA),本研究以纯化的DHAV-C单克隆抗体(MAb)为一抗,FITC标记的兔抗鼠Ig G(Ig G-FITC)为二抗,建立了DHAV-C IFA检测方法。该方法仅对感染DHAV-C的肝组织触片检测为阳性,而对分别感染基因A型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭源金黄色葡萄球菌、鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的SPF鸭肝组织触片检测为阴性,表明该方法特异性好;重复性试验表明,该方法批内和批间重复性好。一抗和二抗在-20℃至少能保存7个月。实验感染SPF雏鸭IFA和RT-PCR检测符合率100%。本研究建立的DHAV-C IFA方法特异性好,可以用于该病毒感染肝组织的快速检测。     

猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体间接ELISA方法的建立

建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

鸭巴泰病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及部分地区的初步流行病学调查

为建立检测新发现的鸭巴泰病毒(BATV)感染的血清学方法及初步了解相关地域BATV的流行情况,本研究以浓缩纯化的BATV ZJ-01株作为包被抗原,通过优化反应条件,建立了BATV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,该方法仅与BATV阳性血清发生特异性反应,而对禽流感病毒等8种常见鸭病毒阳性血清无交叉反应,表明其特异性强;经敏感性试验测定,阳性血清1∶320倍稀释时检测仍为阳性,显示其敏感性高。批内重复试验变异系数低于5%,批间重复试验变异系数低于10%,证明其重复性良好。经30份血清样品的比对检测结果显示,该方法与中和试验符合率为100%。应用该方法对采自闽浙赣三省发生产蛋下降种(蛋)鸭群、生长不良肉鸭群共493份血清样品分别检测,结果总阳性率高达29.41%。本研究为BATV的流行病学调查提供了一种特异、敏感、快速的血清学检测方法。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

基于重组外膜蛋白的猪流产嗜性衣原体病抗体ELISA检测方法的建立

为建立检测流产嗜性衣原体(C.abortus)抗体的快速检测方法,本研究以纯化的重组表达C.abortus主要外膜蛋白(MOMP)为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对反应条件进行优化,建立了C.abortus抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性血清均无交叉反应;该方法检测稀释800倍的C.abortus阳性血清仍呈阳性;批内和批间变异系数均小于10%。采用所建立的ELISA方法与间接血凝(IHA)方法分别对62份临床血清样品进行检测,阳性率分别为83.87%(52/62)和70.97%(44/62),符合率为87.09%(54/62)。由此表明,本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,适于C.abortus流行病学调查。     

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。     

鸭坦布苏病毒JM株E蛋白的截断表达及间接ELISA方法的建立

本研究利用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)JM株E基因截断片段(822 bp),并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组质粒p ET32a-E。重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,经IPTG诱导得到了高效表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。将纯化好的DTMUV E蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。经过条件优化,确定了抗原最适包被浓度为0.093μg/孔,血清的最佳稀释度为1∶100。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.53%和9.73%。用建立的ELISA方法对免疫鸭坦布苏病毒灭活疫苗的鸭血清和对照鸭血清进行抗体检测,同时与攻毒保护试验进行比较,两者的阳性符合率为86.67%,阴性符合率为100%。     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1∶2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%～9.47%,批间变异系数为2.43%～14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。     

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

鸭疫里默氏杆菌Porin蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

旨在建立一种新型可适用于鸭疫里默氏杆菌(RA)病抗体检测的间接ELISA方法。以血清2型RA贵州分离株为研究对象,将其微孔蛋白Proin编码的基因克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-porin,在E.coli BL21(DE3)中使用IPTG诱导后表达。以纯化后的Porin蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化建立一种检测RA抗体的间接ELISA方法,对其性能进行综合评价。结果显示,该方法具有较好的敏感性、重复性及特异性,阳性血清经1∶6 400稀释后检测结果仍为阳性,批内变异系数(CV)在1.27%～4.90%之间,批间CV在2.59%～5.43%之间,该方法可特异性地检测出抗RA抗体,与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及E.coli阳性血清均无交叉反应,与商品化ELISA抗体试剂盒检测相比,两者符合率为97.26%。使用建立的ELISA方法对临床采集的801份样品血清开展抗体检测分析(626份为已免疫鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗“血清1型+血清2型”的样品血清,175份为未免...