草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

康宁木霉cbh2基因的克隆与结构特征分析

克隆得到了康宁木霉AS3.2774的cbh2基因组DNA及cDNA,序列测定表明:基因组DNA全长1583 bp,cDNA全长1413 bp。对比cbh2基因组DNA序列与cDNA序列,证明该基因由4个外显子组成,被3个内含子间断隔开,编码470个氨基酸的多肽。利用Predictprotein软件预测,该蛋白由9个α螺旋结构和10个β折叠结构及其他结构组成,并对其纤维素结构区、2个糖苷水解酶家族6的特征结构区、信号肽等特征性结构区进行了定位。     

Cloning of TaCYP707A1 Gene that Encodes ABA 8'-Hydroxylase in Common Wheat (Triticum aestivum L.)

The plant hormone abscisic acid (ABA) regulates many important physiological and developmental processes in plants.The objective of this study was to clone the ABA 8'-hydroxylase gene in common wheat. In the present study, we used the cDNA sequence of barley HvCYP707A1 gene (GenBank accession no. AB239299) as a probe for BLAST search against the common wheat (Triticum aestivum L.) EST database in GenBank. All wheat ESTs sharing high similarity with the reference gene were subjected to contig assembly. Primers were designed based on the constructed contigs to clone the wheat CYP707A1 gene, designated as TaCYP707AI. The genomic DNA sequence of TaCYP707A1 gene comprised five exons and four introns, with a size of 2 225 bp. The corresponding cDNA sequence of TaCYP707A1 was 1 737 bp,containing an open reading frame (ORF) of 1 431 bp, a 42-bp 5'-untranslated region (UTR) and a 264-bp 3'UTR, with 94.9% of identical sequences to HvCYP707A1 gene (AB239299). The neighbor joining tree indicated that the deduced amino acid sequences of TaCYP707A1 gene was highly similar to those of barley and rice. The TaCYP707A1 gene was located on chromosome 6BL using a set of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 6BS. These results will be of high importance in understanding of molecular mechanism of ABA catabolism.     

河川沙塘鳢GH基因及侧翼的克隆与生物信息学分析

利用长片段PCR、基因组步移法及T-A克隆技术,成功克隆出河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)GH基因全长序列,提交至GenBank获得登录号MH717101。河川沙塘鳢GH基因全序列长5 120 bp,5'端和3'端侧翼序列长度分别为920、682 bp,经预测,上游区域含有MF3、GAGA factor、HNF-3alpha、C/EBP、R2、GATA-1等多种转录调控元件;转录单元长3 518 bp,包含4个内含子和5个外显子,4个内含子大小分别为75、333、2 070和121 bp,5个外显子长度分别为150、131、117、138和373 bp,第3内含子长达2 070 bp,其长度是翘嘴鲌(Culter alburnus)第3内含子的4倍以上;开放阅读框区(open reading frame,ORF)为594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。河川沙塘鳢与鲈形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等13种鱼类的氨基酸序列同源性比较表明,其与彼氏冰鰕虎鱼(Leucopsarion petersii)同源性最高,为83.8%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)同源性最低,为49.1%,在180~197氨基酸序列处,河川沙塘鳢表现出高度不保守性,与所列鱼类氨基酸排列均完全不一致。该研究结果为进一步研究河川沙塘鳢GH基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

马鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析

为获得马鹿(Cervus elaphus)Ghrelin全长cDNA序列并进行序列比较和分析,本试验以马鹿皱胃黏膜组织内提取的总RNA为模板,通过RT-PCR、RACE和基因克隆等技术进行克隆。结果表明:获得长度为539bp的马鹿cDNA全序列(GenBank accession no.KX857494),其中包括46bp的5′非编码区(5′UTR),351bp的开放阅读框(ORF),编码116个氨基酸残基的前原Ghrelin(preproghrelin),128bp的3′非编码区(3′UTR)和poly(A)14;Ghrelin的氨基酸同源性分析表明,马鹿Ghrelin cDNA全序列与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊、牛等物种间的同源性较高,进化树分析与其亲缘关系远近一致。     

牛BMP3基因cDNA克隆及组织表达谱分析

用RT-PCR的方法克隆了鲁西黄牛BMP3基因1 555 bp的eDNA序列,该序列包含1个1 428 bp的完整开放阅读框,编码476个氨基酸残基;通过对推导的牛BMP3蛋白进行生物信息学分析发现,牛BMP3蛋白的分子量为53 506.27 D,等电点为9.42,该蛋白前22个氨基酸残基为信号肽序列,而亚细胞定位分析发现,该成熟蛋白可能位于细胞外.通过与最新公布的牛基因组比对,发现牛BMP3基因位于牛基因组第6号染色体上,由3个外显子和2个内含子组成,牛BMP3基因cDNA序列与人、小鼠、大鼠和鸡BMP3基因cDNA序列的相似性分别达到84%,81%,81%,79%,是进化上保守的基因.在牛卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺等组织中都检测到BMP3基因表达,表明牛BMP3基因是一个功能重要、进化保守的基因,具有广泛的组织表达谱.     

花生共生受体类蛋白激酶基因的克隆及生物信息学分析

共生受体类蛋白激酶（symbiosis receptor-like protein kinase, SYMRK）是控制植物与微生物共生的关键调控基因,利用基因组步移技术,克隆得到花生symrk的全长基因及其560 bp的ATG上游序列。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的常规理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和高级结构等进行了预测和分析,结果表明Ah-symrk由15个外显子和14个内含子组成,cDNA全长3 042 bp,包含2 781 bp的ORF,编码926个氨基酸,为疏水性酸性蛋白质,定位于细胞膜;ATG上游序列包含3个与根特异表达有关的顺式作用元件root motif tapox1;RT-PCR验证,该基因在花生根中特异性表达。     

Genomic structure and sequence polymorphism of E,E-alpha-farnesene synthase gene in apples (Malus domestica Borkh.)

Primer pairs were designed to amplify the genomic DNA sequence of the alpha-farnesene synthase (AFS) gene by PCR. The PCR products were sequenced, spliced and compared to cDNA sequences in the GenBank (accession No. AY182241). The genomic sequence and intron-exon organization of the AFS gene were thus obtained. The AFS genomic sequence has been registered in the GenBank (accession No. DQ901739). It has 6 introns and 7 exons, encoding a protein of 576 amino acids. The sizes of the 6 introns were 108 bp, 113 bp, > 1000 bp, 125 bp, 220 bp and 88 bp, and their phases were 0, 1, 2, 2, 0, 0, respectively. The sizes of the deduced amino acids of the 7 exons were 57, 89, 127, 73, 48, 83 and 99, respectively. The AFS protein contained three motifs: the RR(X8)W motif encoded by a sequence in exon 1, and the RxR motif and DDxxD motif encoded by two sequences in exon 4. After comparing the AFS genomic sequence (accession No. DQ901739) to the cDNA sequence (accession No. AY523409) in the GenBank, it was found that there were 6 single-nucleotide polymorphisms between the two sequences, four of which caused mutations at the amino acid level. Interestingly, one amino acid mutation (291R → RG) was found in the RxR motif, and further investigation is needed to determine whether the alpha-farnesene synthesis ability and superficial scald susceptibility of apples are influenced by this amino acid mutation and other mutations. __________ Translated from Acta Horticulturae Sinica, 2007, 34(4): 1003–1006[译自: 园艺学报]     

梅花鹿Ghrelin全长cDNA克隆及其序列分析

为获得梅花鹿Ghrelin cDNA全序列,以梅花鹿皱胃黏膜上皮组织提取的总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE法克隆了梅花鹿皱胃中Ghrelin基因cDNA的全序列。结果表明梅花鹿Ghrelin cDNA序列全长为539bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为46bp,3’UTR为128bp,开放阅读框(ORF)为351bp,该ORF编码116个氨基酸残基。将梅花鹿Ghrelin基因的cDNA与人和其他动物的Ghrelin相比,发现:梅花鹿Ghrelin与驯鹿、山羊、绵羊和牛的同源性达90.4%~99.1%;与恒河猴、人、猪、犬的同源性达76.6%~66.9%;与鸡和野鸽的同源性分别为36.4%和35.4%。研究表明Ghrelin的结构具有明显的种属特异性,因此Ghrelin在反刍动物体内可能有着重要的生理功能。     

水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。     

水稻盐胁迫相关基因sos 5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%.     

来源于Chaetomium cupreum的几丁质酶chi58基因克隆及特性分析

以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。     

日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牛儿基牛儿基氢化酶(GGH)基因cDNA序列为信息探针,搜索GenBank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1 389 bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架(ORF),推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牛儿基牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91%、89%、84%、81%7、3%、74%。该基因与叶绿素等的生物合成有关。     

黄鳝nanos3基因克隆鉴定及其组织表达分析

【目的】明确nanos3基因在黄鳝卵巢发育和维持过程中的重要作用,为黄鳝PGCs可视化分子标记、生殖细胞移植及性腺发育分化机制研究打下基础。【方法】通过RACE克隆黄鳝nanos3基因cDNA序列,运用ProtParam、 SOMPA、 SWISS-MODEL、 SignalP、 TMHMM及NetPhos等在线软件进行nanos3蛋白生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR检测nanos3基因在黄鳝不同组织中的表达情况,并以冰冻切片荧光原位杂交进行性腺组织定位。【结果】黄鳝nanos3基因cDNA序列全长1289 bp,包括147 bp的5'非编码区 （5'-UTR）、 531 bp的开放阅读框 （ORF）及611 bp的3'非编码区（3'-UTR）,共编码176个氨基酸残基。黄鳝nanos3蛋白分子量为19.61 kD,理论等电点（pI）为9.07,为碱性蛋白;在黄鳝nanos3氨基酸序列第108~162位处存在2个锌指基序 “CCHC”结构域,无信号肽和跨膜结构域;蛋白二级结构以无规则卷曲的占比最高 （64.20%）,其次是α-螺旋 （占24.43%）,延伸链、 β-转角的占比分别为6.82%和4.55%。黄鳝与大刺鳅、射水鱼、斑马鱼等鱼类的nanos3氨基酸序列相似性分别为67.5%、 57.2%和50.3%,与中国林蛙、粗皮蛙等两栖类动物的相似性分别为39.3%和30.3%,与人类、小鼠等哺乳类动物的相似性分别为33.3%和30.9%。nanos3基因在黄鳝肌肉中不表达,在精巢、肾脏、脾脏、脑、肝脏、肠道、心脏和血液中的相对表达量较低,在卵巢中的相对表达量最高,极显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.01）,呈明显的组织特异性表达模式;冰冻切片荧光原位杂交分析结果显示,黄鳝nanos3基因仅在生殖细胞中表达,支持细胞中未见表达。【结论】黄鳝nanos3基因进化相对保守,主要在卵巢的生殖细胞中表达,且以细胞质中的表达为主,与核遗传信息的传递相关,是黄鳝性腺发育及分化相关的功能基因。     

象草CCR基因的克隆与生物信息学分析(英文)

[目的]从能源植物象草中克隆出参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列及全长DNA序列,进而分析其序列特征。[方法]采用传统RT-PCR及RACE技术克隆象草CCR序列,并利用NCBI,ProtParam,ProtScale,TMHMM,TargetP,SignalP,Pfam20.0,Prosite,Swiss-Model和ClustalW2等在线分析程序以及DNAman,DNAstar和MEGA5软件对得到的序列进行生物信息学分析。[结果]克隆得到了象草CCR包含编码区和3’非翻译区的长为1316bp的cDNA序列以及包含5个外显子和4个内含子的全长为6133bp的DNA序列。通过生物信息学分析得知,象草CCR基因编码长为369个氨基酸的蛋白,该蛋白二级结构元件以无规则卷曲和α-螺旋为主,属于依赖NAD表异构酶/脱氢酶家族,其辅助因子结合区域和底物结合位点高度保守。[结论]成功从象草中克隆出肉桂酰辅酶A还原酶基因。它具有CCR同源基因典型的特征。获得的各种生物信息学数据为今后开展此酶的深入研究以及对象草的更好利用提供了一定的理论参考价值。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

日本百脉根牻牛儿基牻牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牻牛儿基牻牛儿基氯化酶（GGH）基因cDNA序列为信息探针,搜索GenRank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1389bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架（ORF）,推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牻牛儿基牻牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91％、89％、84％、81％、73％、74％。访基因与叶绿素等的生物合成有关。     

Cloning and Sequencing of a Gene Encoding GOBP2 in the Antenna of Spodoptera exigua

A pair of degenerate primers was designed, based on the comparison of five insects‘ GOBP2 gene sequences reported previously. A specific band (about 400bp in length) was amplified from cDNA of Spodoptera exigua antenna and another specific band (about 2kb in length) was amplified from genomic DNA.The two segments were cloned into T-easy vector, respectively. Results of sequencing and structural analysis showed that the full-length of GOBP2Sexi ORF is 426bp, 141 amino acid residues were encoded. The predicted MW and pI are 16.07ku and 5.09, respectively. There are six conservative Cys locus in the sequence, which is the typical characteristic of OBPs. GOBP2Sexi gene was inserted by two introns between amino acid residue 22 and 23 and between 82 and 83. The length of two introns is 160bp and 1403bp. Results of Northern blot showed that GOBP2 gene expressed specifically in the antenna of Spodoptera exigua, and the expression level is nearly equal in the antenna of male and female moths. The sequence was deposited in GenBank/EMBL and the accession number is AJ294809.