糙皮侧耳HMG-box转录因子分析与候选基因克隆表达

在糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的全基因组中鉴定出14个高速泳动蛋白(high-mobility group box,HMG-box)的编码基因(PoHMG1～PoHMG14)，对其进行特征、结构与系统进化分析，发现所有的HMGbox转录因子蛋白的三级结构高度相似，相对分子质量为6893.79～60397.29，蛋白PoHMG6、PoHMG11、PoHMG12与PoHMG13之间的亲缘关系较近。基于糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体时期的转录组数据，对筛选到的转录因子基因PoHMG11进行克隆分析并探究其功能及表达特性，发现该基因全长序列1 517 bp，编码489个氨基酸，含有一个HMG-box结构域。通过大肠杆菌原核表达载体体外诱导表达出相对分子质量为5.5×104的蛋白，该重组蛋白在1 mol·L^-1 IPTG、25℃诱导表达6 h时表达量最高。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体阶段PoHMG11基因的相对表达量，发现该基因在成熟糙皮侧耳子实体中的表达量比其他生长发育时期显著...     

金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因的鉴定与表达分析

以金针菇基因组与转录组数据为基础,通过本地BLAST方法鉴定金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因,命名为GENE5116,并对其结构、编码蛋白的基本性质与表达模式进行了分析,以期了解其在金针菇子实体生长发育过程中的作用。结果表明:该基因有9个外显子,8个内含子,基因总长为1998 bp,共编码438个氨基酸残基,相对分子质量为48987.36,等电点8.83;系统进化分析结果表明该基因与真菌E3泛素连接酶具有高度同源性,与陶兰柱担菌(Cylindrobasidium torrendii)亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明该基因在菌柄的表达量最高且菌柄上部基因表达量显著高于下部,在菌丝的表达量最低,所以推测该基因可能与子实体菌柄伸长有关。     

金针菇疏水蛋白编码基因fvh1和fv-hyd1在双、单核菌株不同发育阶段的定量表达研究

以金针菇(Flammulina velutipes)双核菌株G和单核菌株dan3为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术,比较fvh1和fv-hyd1基因在不同生长发育阶段中的相对表达量差异。实时荧光定量PCR结果显示:基因fvh1在双核菌株G中,菌丝阶段的相对表达量显著高于原基和子实体阶段,而单核菌株dan3中,测试3个阶段的相对表达量无显著差异;基因fv-hyd1在双核菌株G和单核菌株dan3中,原基阶段相对表达量均显著低于子实体阶段,而菌丝阶段表达量未检测到。     

蝴蝶兰PhSVP的克隆及其在花发育过程中的表达分析

从蝴蝶兰杂交品种‘大辣椒’中克隆到SVP同源MADS-box基因PhSVP，使用RACE方法获得PhSVP全长，其开放阅读框为687 bp，编码228个氨基酸。蛋白序列多重比对表明PhSVP蛋白包含一个高度保守的MEF2-like MADS结构域和一个中度保守的K-box结构域，且与兰科的SVP/AGL24同源蛋白相似度高，进化树分析也表明PhSVP蛋白与其他兰科植物的SVP/AGL24同源蛋白亲缘关系最近。PhSVP的空间表达模式表明其在营养器官表达量高，在萼片、侧瓣和唇瓣等生殖器官表达量低。进一步对PhSVP在成花转换和花发育过程中花序顶端的表达进行分析，表明PhSVP的转录水平在营养分生组织向花序分生组织过渡的过程中无显著变化，仅在花序分生组织阶段有少量上升，但在花发育早期花分生组织阶段中的表达水平显著升高，而在花发育后期的萼片原基、花瓣原基和合蕊柱原基阶段持续下降。此外还发现A类基因PhAP1在花发育过程中的花序顶端的表达模式与PhSVP相似，而B类基因PhPI和C类基因PhAG在花瓣原基和合蕊柱原基阶段的表达量最高。检测了PhSVP在抽葶期、花蕾期和盛花期的根、叶和花葶中的转录水平，结果表明PhSVP在花蕾期的根中的表达量稍高于其他时期，在不同阶段的叶中的表达水平无显著差异，而在抽葶期花葶中的表达量显著高于花蕾期和盛花期。试验结果暗示蝴蝶兰PhSVP可能起到调控花分生组织状态的维持、避免花器官原基过早分化的作用。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSUL3.5 的克隆与表#br# 达分析

 采用电子克隆与RT-PCR 相结合的方法获得茶树硫酸盐转运蛋白（CsSUL3.5）的cDNA 序 列,并进行了相关生物信息学分析。克隆到茶树CsSUL3.5 cDNA 序列2 017 bp（GenBank 登录号 KP984500）,包含完整的开放阅读框（ORF）1 914 bp,编码637 个氨基酸。生物信息学分析显示,CsSUL3.5 编码的蛋白分子量为70.38 kD,无信号肽,是疏水性的非分泌蛋白,有11 个跨膜区;与其他物种相似性 均在60%以上,与烟草的相似性最高（74%）,具有硫酸盐转运蛋白家族典型的保守结构域和空间结构, 属于硫酸盐转运蛋白家族。系统进化分析表明茶树的CsSUL3.5 属于第3 亚家族,与芝麻的关系比较近。 荧光定量PCR 表明该基因在茶树幼苗根与成熟叶中均有表达;Na2SO4 与Na2SeO4 处理均能显著诱导 CsSUL3.5 的表达。     

黑木耳Mn-SOD基因的分子克隆与表达分析

以黑木耳DL202为试材，采用RT-PCR技术克隆了Mn-SOD基因全长，并对其进行生物信息学分析和表达分析，以期为进一步研究Mn-SOD基因在黑木耳抗逆过程中的功能奠定基础。结果表明：Mn-SOD基因cDNA全长为609 bp,编码202个氨基酸，命名为Ah-MnSOD;蛋白具有锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)家族的保守结构域，不具有跨膜结构和信号肽；亚细胞定位主要位于过氧化物酶体中；系统进化分析表明Ah-MnSOD与Auricularia subglabra亲缘关系最近。此外，构建了Ah-MnSOD基因的原核表达载体并成功诱导出目的蛋白。荧光定量PCR结果显示Ah-MnSOD基因在不同发育阶段均有表达，且在原基中表达最高。     

甘蓝BoPID基因的克隆与分析

在通过酵母双杂交文库获得了与钙响应蛋白BoSPx相互作用蛋白BoPID的基础上,对BoPID的编码基因进行了克隆、时空特异性表达分析及筛选与其互作的蛋白,以期为BoSPx通过BoPID参与自交不亲和性分子过程提供依据。结果表明,BoPID包含2个外显子和1个内含子,编码439个氨基酸。激酶磷酸化预测分析显示具有激酶活性;系统进化和共线性分析显示BoPID具有较强的植物种属特异性,与芜菁、拟南芥和甘蓝型油菜等十字花科植物聚类在一起,BoPID与AtPID在染色体水平上高度同源。组织特异性表达分析显示BoPID在柱头中的表达量高于花器官中的其他部位。荧光定量PCR分析表明BoPID在甘蓝柱头自花授粉15 min显著上调表达,而后下调表达。启动子元件分析发现BoPID含有ABA、IAA、脱落酸、茉莉酸、水杨酸和胁迫响应等多个应答元件。BoPID蛋白定位于细胞膜和细胞质中,可能是一种泊位于膜上并突触于胞质中的双栖蛋白。酵母双杂交和GST-Pulldown结果表明BoPID与BoCML12、BoCaM2、BoPIN1能够发生相互作用。BoPID可能是BoSPx与Bo CML12、BoCaM2之间相互作用的桥梁蛋白,共同通过生长素调节钙响应的方式参与了自交不亲和分子过程。     

苹果溶质转运蛋白基因MdSLC35F2-like表达与花青苷积累的研究

以‘长富2’苹果片红芽变的果皮为试材,克隆了溶质转运蛋白家族基因Md SLC35F2-like(Solute Carrier Family 35 Member F2-like)的开放阅读框（ORF）,其长度为1 041 bp,编码346个氨基酸。利用在线软件进行生物信息分析,该蛋白是1个稳定的疏水性α螺旋跨膜蛋白,定位于细胞膜。同源性分析表明,Md SLC35F2-like与白梨的Pb SLC35F1-like同源性最高;系统进化分析表明,其与白梨的进化亲缘关系最近,与可可、巨桉的进化亲缘关系最远。分析‘长富2号’及其片红芽变果实着色期花青苷的积累与Md SLC35F2-like表达量的变化,结果表明,摘袋后Md SLC35F2-like表达量在‘长富2号’及其2个片红芽变果实果皮中均呈先升高后降低的趋势,在摘袋后3d表达量最高,而后逐渐降低,2个芽变材料均显著高于其野生型,表达量与花青苷含量呈正相关关系。在其他颜色品种上进行验证分析,Md SLC35F2-like在红色果皮品种‘烟富3号’果皮中的表达量极显著高于绿色果皮品种‘金陵’,在红色果肉品种‘红色之爱’果肉中的表达量显著高于白...     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSUL3.5的克隆与表达分析

采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法获得茶树硫酸盐转运蛋白(CsSUL3.5)的cDNA序列,并进行了相关生物信息学分析。克隆到茶树CsSUL3.5 cDNA序列2 017 bp(GenBank登录号KP984500),包含完整的开放阅读框(ORF)1914 bp,编码637个氨基酸。生物信息学分析显示,CsSUL3.5编码的蛋白分子量为70.38 kD,无信号肽,是疏水性的非分泌蛋白,有11个跨膜区;与其他物种相似性均在60%以上,与烟草的相似性最高(74%),具有硫酸盐转运蛋白家族典型的保守结构域和空间结构,属于硫酸盐转运蛋白家族。系统进化分析表明茶树的CsSUL3.5属于第3亚家族,与芝麻的关系比较近。荧光定量PCR表明该基因在茶树幼苗根与成熟叶中均有表达;Na_2SO_4与Na_2SeO_4处理均能显著诱导CsSUL3.5的表达。     

苹果赤霉素信号转导因子MdGAMYB的克隆和表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,从其短枝顶芽中克隆得到1个赤霉素信号转导因子MdGAMYB,对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,MdGAMYB的开放阅读框(ORF)长度为1 656bp,编码551个氨基酸,蛋白质分子量为59.741 kD。生物信息学分析表明MdGAMYB编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点;序列分析表明,Md GAYMB和其他物种的GAMYB蛋白有很高的相似性,均含有保守的R2R3 DNA结合域和GAMYB家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域;系统进化分析表明,Md GAYMB与梨、梅花、草莓、枣和葡萄等的GAMYB蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Md GAYMB具有组织表达特异性,在叶片、花和芽中的表达量较高。外源GA3处理抑制了花芽孕育和翌年成花,抑制MdGAMYB的表达。在易成花品种‘烟富6号’中的表达量高于难成花品种‘长富2号’。     

丹参DHAR家族基因的鉴定及表达模式分析

运用生物信息学方法,从丹参（Salvia miltiorrhiza）基因组数据库中鉴定得到5个脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase,DHAR）家族成员SmDHAR1 ~ SmDHAR5,分析了基因结构特征、编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、高级结构、系统进化关系以及启动子顺式作用元件,并考察了其在不同组织及胁迫下的表达模式。结果表明,SmDHAR基因家族成员长度在724 ~ 3 296 bp之间,含有1 ~ 5个外显子不等,编码218 ~ 470个氨基酸;其编码蛋白多为亲水性蛋白,且多不含跨膜结构域。SmDHAR家族成员分布在叶绿体和胞质外。系统进化分析结果显示丹参SmDHAR基因分为2个亚类。上游启动子区域分析发现SmDHAR基因家族成员均含有与植物发育、激素及胁迫响应相关的顺式作用元件。表达模式分析结果显示,SmDHAR5在丹参根中显著高表达,而在其余组织中表达量较低;SmDHAR1、SmDHAR3与SmDHAR4在根、茎、叶中表达量较高,在花组织中表达最低;SmDHAR2表现为组成型高表达。SmDHAR在茉莉酸甲酯、酵母提取物、脱落酸、赤霉素、水杨酸等处理时也表现出不同的响应模式。本研究的结果为深入探索丹参DHAR基因家族在抵抗逆境过程中的功能提供了参考。     

利用转录组分析香菇子实体不分化组织

利用转录组分析香菇（Lentinula edodes）不分化组织与正常原基，探讨香菇子实体发育机制。结果表明：与正常原基相比，不分化组织中差异表达水平≥6的基因有62个（上调表达基因49个，下调表达基因13个），其中2个逆转座子核心蛋白基因上调表达，4个热激蛋白基因下调表达。GO功能富集分析结果显示，差异表达基因主要富集于细胞膜组件、细胞膜组成成分、细胞膜固有成分、胞内膜结合细胞器、膜结合细胞器这5个二级分类单元中。KEGG代谢途径富集分析结果表明，差异表达基因主要富集于精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，次生代谢物的生物合成，氧化磷酸化与MAPK信号通路等。     

糙皮侧耳凝集素基因Plectin的克隆和表达分析

基于cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了两个糙皮侧耳凝集素基因Plectin1和Plectin2。结构分析显示Plectin1和Plectin2基因全长分别为1 371和1 359 bp,二者均含有5个外显子和4个内含子;Plectin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,Plectin2开放阅读框长1 122 bp,编码373个氨基酸。Southern杂交试验证实Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳基因组中均只有1个拷贝。利用qRT-PCR分析了Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳不同生长阶段的表达量,结果显示Plectin1和Plectin2分别在成熟子实体阶段和幼嫩子实体阶段表达量最高,这表明Plectin1和Plectin2基因可能在糙皮侧耳子实体生长发育中起到一定的调控作用。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

灰树花一级菌及栽培菌种培养基的筛选优化

以PDA培养基为基础培养基,添加不同比例麸皮饱和溶液,比较灰树花一级种生长情况;同时以北方常用的木屑培养基为对照,添加不同比例玉米面和麸皮,比较灰树花栽培种生长情况及后期子实体原基出现情况。结果表明:添加8%比例麸皮的培养基中一级种菌丝生长速度快,菌丝粗壮;而栽培种培养基筛选中配方3的菌丝生长速度快,且子实体原基出现较早。     

萝卜AHP基因家族鉴定与表达模式分析

细胞分裂素在植物生长发育和抵御系列非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为了探讨萝卜(Raphanus sativus L.)细胞分裂素信号转导途径中组氨酸磷酸转运蛋白(AHP)的生物学功能与表达模式,对萝卜AHP基因家族成员的数量、进化关系、顺式元件、基因结构、发育及非生物胁迫下基因表达模式进行分析。结果表明,萝卜AHP基因家族有6个成员,其中RsAHP2和RsAHP5为片段重复基因,RsAHP3和RsAHP4为串联重复基因;系统进化分析发现萝卜、拟南芥和白菜的AHP家族具有同源性;其启动子序列中含有光响应、激素响应和防御应激等顺式作用元件;萝卜AHP均在根中表达量高而在叶中表达量低;不同非生物胁迫条件下,RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5差异表达显著。研究结果可为解析萝卜AHP基因功能提供理论依据。     

灵芝Gal-0201的生物学特性及有效成分分析

采用玉米芯、稻草、木屑和棉子壳为培养基,在16℃、21℃、25℃和31℃下培养观察Cal-0201生长特性。结果表明:Gal-0201的最适生长温度是26～30℃,最佳培养基是棉子壳;其在木屑培养基上不能形成原基,在稻草培养基上可形成原基但不能形成正常的子实体。以棉子壳为培养基,以赤芝8号(Gal-8)为对照对Gal-0201子实体的干重、含水量、粗蛋白含量、多糖含量、灰分、氨基酸含量进行了测定。结果表明:Gal-0201子实体的氨基酸含量、多糖含量以及灰分均比对照Gal-8高,其它成分与赤芝8号没有显著差异,是一个有开发价值的灵芝新资源。     

不同光质照射下真姬菇的生长发育与光受体的响应表达

采用 5 种不同光质光源,分别对真姬菇（Hypsizygus marmoreus）的菌丝、原基和子实体进行照射,检测菌丝生长速度、原基形成数量、子实体菌柄长度、菌柄直径、菌盖直径以及产量等。结果显示：真姬菇菌丝在黑暗和红光下生长较快,在红绿蓝复合光下生长最慢;在蓝光下形成的原基数量最多,而在红光下原基数量最少;子实体阶段,黑暗下菌柄的长度及直径最大,绿光下菌柄长度及直径最小;而在蓝光和红绿蓝复合光下菌盖直径最大。相同培养时间,真姬菇在黑暗和蓝光下产量较高,在绿光下产量最低。进一步检测真姬菇光受体基因 WC1 和 WC2 在不同光质条件下的差异表达。结果表明,在菌柄中 WC1 在黑暗下表达量最高,WC2 在蓝光下表达量最高;而在菌盖中 WC1 和 WC2 均在蓝光下表达量最高。     

桂花C4H基因的克隆与表达特性分析

利用转录组测序获得的表达序列信息,结合RACE技术,从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其ORF全长分别为1 518 bp和1 611 bp,各自编码505和536个氨基酸,命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。系统进化树表明,OfC4H1与矮牵牛中的PhC4H1、PhC4H2等C4H蛋白聚为一类,属于Class Ⅰ类型;OfC4H2与金银花中的LjC4H等属于ClassⅡ类型。进一步的C4H蛋白序列多重比较发现,OfC4H1和OfC4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域,在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式,结果显示,OfC4H1在花瓣中的表达量最高;OfC4H2在花瓣中的表达量较低,在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs,转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明,目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达,而且与预期大小一致,但因溶解度较低无法进行酶活性分析。     

芹菜AgHAT4的克隆与表达模式分析

以两个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为试验材料，分别克隆获得HAT4转录因子基因AgHAT4。应用生物信息学方法分别从氨基酸组成、蛋白结构与理化性质、以及系统进化树等方面对该基因进行分析。结果表明，AgHAT4含有1个长为900 bp的开放阅读框（ORF），编码299个氨基酸。‘六合黄心芹’和‘文图拉’中的AgHAT4基因有1个核苷酸位点的差异，编码的氨基酸有1个位点的差异，其蛋白质相对分子质量分别为33.71和33.68 kD，等电点均为9.12。进化树分析表明芹菜AgHAT4与胡萝卜的HAT4属于同一分支。蛋白结构预测显示，该蛋白主要由3个α螺旋和一些无规则卷曲构成，且未定位到信号肽。荧光定量PCR结果表明，AgHAT4在芹菜叶柄中的表达量最高，根中次之，叶片中表达量最低。多种非生物胁迫导致芹菜AgHAT4的表达量发生变化。与未胁迫对照相比，高温胁迫处理后‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达量在24 h明显上调，在盐胁迫条件下‘文图拉’和‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达有着相似的变化趋势，均先上升后下降且在处理2 h后表达量达到峰值。‘文图拉’中AgHAT4的表达量在高温处理4 h后表达量最高，而在低温条件下在处理2 h后表达量最高。