抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

小麦耐盐相关基因TaRSTR的克隆与功能分析

高盐是限制植物生长和发育的重要非生物胁迫因子。以耐盐小麦RH8706-49根部基因表达谱芯片结果为基础,利用电子克隆和RT-PCR方法克隆了一个盐胁迫时上调表达的基因,命名为TaRSTR(登录号:EU263918)。荧光定量PCR分析证实该基因受盐胁迫诱导表达,亚细胞定位结果显示TaRSTR蛋白定位在细胞核里。TaRSTR过表达提高了转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因过表达可显著提高已知耐盐相关基因At FRY1、At P5CS1和AtRD29B的表达量,推测TaRSTR基因通过这些标记基因提高了转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明TaRSTR基因过表达能提高植株的耐盐性,是植物耐盐的正调节子。     

Na~+转运蛋白SKC1基因转化大豆的研究

本研究构建了水稻Na+转运蛋白SKC1基因植物表达载体pTF-SKC1,标记基因为Bar基因。以子叶节为外植体,利用农杆菌介导法将SKC1导入大豆中。经过除草剂抗性筛选后获得的再生植株经PCR方法鉴定,转基因植株阳性率为50%,初步证明SKC1基因已整合到大豆基因组中。耐盐性试验结果表明,转基因植株的耐盐性高于对照。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

多启动子驱动苘麻epsps优化基因植物表达载体的构建及其转化

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官优势表达的arf1启动子、棉花草甘膦高效诱导表达的ag2启动子和组成型启动子CaMV35S驱动苘麻epsps优化基因的串联三表达盒植物表达载体,采用农杆菌喷花法将其转入棉花,对T0代喷施草甘膦筛选获得8株对草甘膦有较强抗性并且生殖发育正常的植株;PCR和RT PCR分析表明外源基因已整合至棉花基因组并正确表达。为探索用不同类型启动子驱动相同基因以扩大外源基因在植物中的表达范围和培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花打下基础。     

基于mCherry荧光蛋白的植物基因过表达遗传转化系统的初步研究

过量表达是植物基因功能鉴定和农作物遗传改良的重要途径。为了提高转基因植株的研究效率,以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建了由玉米泛素启动子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列组成过量表达框的转基因载体。分别将4个水稻类受体激酶的编码序列插入表达框,通过农杆菌介导转化水稻品种泰粳394。转基因植株T1种子的m Cherry荧光检测结果表明,平均62.5%的T1株系呈3∶1分离。根据实时定量RT-PCR分析结果,过表达阳性植株的目的基因相对表达量显著高于阴性植株和未转化的泰粳394。运用该载体系统,能够进行转基因后代大规模筛选,获得目的基因过量表达的转基因株系,从而促进植物基因功能研究和转基因应用研究。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

一种无标记基因植物表达载体的改造方法

利用无标记基因表达载体开展转基因植物研究,是获得无标记基因转基因植物、保证转基因生物安全的手段之一。文章报道了一种无标记基因植物转化载体的改造方法,通过AseⅠ单酶切可去除pCAMBIA1300植物转化载体内潮霉素标记基因完整表达框架。试验应用结果表明,利用此表达载体进行共转化研究,可获得不含标记基因、只含目的基因的转基因植株。此方法可在植物共转化研究中广泛应用。     

基因枪共转化将拟南芥DREB2A基因和bar基因导入小麦

为了提高小麦的抗旱耐盐性,采用PCR方法克降了拟南芥DREB2A(AtDREB2A)基因,构建了由水稻Actin启动子驱动的组成型表达载体,通过基因枪共转化途径,将AtDREB2A基因和抗除草剂筛选bar基因同时导入小麦品种Alondra和扬麦12,bar基因、AtDREB2A基因的转化频率以及两基因的共转化频率分别达到2.4%、0.4%和0.2%.对部分阳性植株进行RT-PCR分析表明,导入的AtDREB2A基因和bar基因均获得稳定表达.本研究获得的共转化植株为今后剔除筛选标记基因、培育安全的抗旱耐盐小麦新种质奠定了基础.     

蚓激酶F-Ⅲ-1基因植物表达载体的构建

[目的]探讨蚓激酶F-III-1基因在烟草中的高效表达。[方法]以经烟草密码子优化、人工合成的蚓激酶成熟肽F-III-1为目的基因,以p CAMBIA3301和p BA002质粒为基础,构建由35S启动子调控、抗草铵膦基因(bar)为选择标记的植物表达载体。[结果]成功构建了4个植物表达载体,分别是p CAMBIA3301-F-III-1、p CAMBIA3301-F-III-1-6x His、p BA002-F-III-1和p BA002-F-III-1-6x His。[结论]4个植物表达载体的成功构建为探讨蚓激酶在植物中的表达及其植物反应器生产奠定了基础。     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。     

双T-DNA反式串联植物表达载体构建与验证

通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物表达载体成功地将非连锁共整合的频率分别由47.37%和45.83%提高到了55.81%和51.28%,提高无选择标记基因转基因植株的筛选效率。     

深海嗜热菌超氧化物歧化酶基因耐盐性研究

为探究深海嗜热菌(Thermophile thermus)中铁离子超氧化物歧化酶Fe-SOD基因(Tt SOD)与植物耐盐性的关系,对该基因的全长序列进行了分析,构建了Tt SOD基因过量表达载体,并将该过量表达载体成功转化烟草中,获得转基因植株。结果表明,该基因全长615 bp,是典型的Fe-SOD。转Tt SOD基因烟草中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著提高,而丙二醛(MDA)含量显著降低;转基因烟草的种子萌发率、叶绿素和类胡萝卜素含量显著提高。本研究的结果表明植物过表达Tt SOD基因,提高了转基因烟草耐盐能力,为选育作物耐盐性新品种提供技术参考。     

抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化

【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.     

转Mz_2NHX_1基因拟南芥对盐胁迫的生理响应

为了探讨珠美海棠Na~+/H~+逆向转运蛋白基因Mz_2NHX_1在植物耐盐中的作用,以野生型拟南芥和转Mz_2NHX_1基因拟南芥为材料,研究不同盐浓度对转基因和野生型拟南芥种子萌发、植株耐盐性相关生理指标的影响。结果表明:在不同盐胁迫下,转基因拟南芥种子发芽率明显高于野生型。随着盐浓度的增加,野生型和转基因植株的电导率呈上升趋势;SOD活性呈先上升后下降趋势;POD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量在野生型植株中呈先上升后下降趋势,在转基因植株中呈不断升高的趋势。盐胁迫下,转基因植株的各项生理指标均优于野生型,表明Mz_2NHX_1基因的过量表达,提高了转基因拟南芥的耐盐性。     

GOX-CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究

利用Genome walking方法在孟山都抗农达油菜(Brassica napus L.)中克隆了GOX-CP4EPSP双顺反子结构。利用农杆菌介导的遗传转化方法将PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物双元表达载体转化甘蓝型油菜Pol CMS恢复系"7-5"获得转基因植株。在田间对转基因植株喷施400倍的农达(41%草甘膦异丙胺盐),所有的转基因家系都能存活,而非转基因Pol CMS恢复系"7-5"全部死亡。在转基因植株叶片中能够检测到GOX和CP4EPSP基因的表达。对转基因T1代3个家系在60 mg/L草甘膦培养基上的发芽试验以及GUS染色分析表明抗草甘膦的单株能表达与GOX-CP4EPSP共转化的GUS蛋白质,而对草甘膦敏感的单株和野生型对照植株都不能表达GUS蛋白质。鉴于GOX-CP4EPSP双顺反子在转基因油菜中的有效性和稳定性,可以作为双子叶植物遗传转化的筛选标记。     

草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

【目的】草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义.【方法】构建由Ubiquitin1启动子驱动的两种叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因,和根特异性启动子GLU1P驱动的植酸酶基因phyA2双价植物表达载体,通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化.对转基因植株进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析、不同浓度草甘膦检测以及丙酮-磷钼酸铵法测定.【结果】获得9株阳性转基因植株;发现不同转运肽对EPSPs基因的表达量影响不同,且对草甘膦的抗性也不同;转基因植株植酸酶活性比野生型植株平均提高18.7倍.【结论】本研究为获得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用复合性状的转基因玉米优良种质奠定了基础.     

一种新型降钙素基因相关肽基因转化番茄的研究

按植物偏爱密码子设计合成一种新型降钙素基因相关肽基因(mcgrp),构建植物双元表达载体p35S-2300:: mcgrp::noster,通过农杆菌介导法转化番茄,获得卡那霉素抗性植株27株;经PCR和Southern blot检测有2株为独立的转基因阳性苗,阳性率为7．4%;通过RT-PCR检测,证实外源基因mcgrp在转基因番茄中成功表达(转录水平)。该研究为进一步利用植物系统表达降钙素基因相关肽研究做必要准备。     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。