水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

农杆菌介导的水稻Waxy基因过量表达的初步研究

采用RT-PCR技术克隆水稻Waxy基因,并构建该基因的过量表达载体,在农杆菌介导下利用建立的水稻遗传转化体系将目的基因转入水稻。转基因水稻经PCR检测及实时定量PCR拷贝数检测均表明外源基因已成功导入水稻,且多数为单拷贝插入。半定量PCR检测结果显示,导入水稻的外源Waxy基因已成功表达,并使得该基因的表达量较对照有明显提高。水稻Waxy基因过量表达载体的成功转化,将为该基因功能的深入研究及水稻直链淀粉合成的调控奠定基础。     

斑茅SAMDC基因的克隆及其原核表达分析

以斑茅(Erianthus arundinaceus)samdc基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体pET-29a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组斑茅samdc基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为43.281kDa.斑茅samdc基因原核表达载体的成功构建和重组斑茅SAMDC蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

肿瘤坏死因子α单链抗体基因的优化及衣藻叶绿体表达载体的构建

通过在EMBL数据库中搜索鼠源TNF-α单链抗体基因同源性最高的人胚系抗体基因TNF-α-ScFv,进行人源化改造,并选择衣藻叶绿体偏爱的密码子对TNF-α-ScFv基因进行优化,随后构建带psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框的中间载体,再将psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框插入衣藻叶绿体表达载体p322中,通过PCR和酶切鉴定,确定已成功构建了TNF-α-ScFv基因的衣藻叶绿体表达载体。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

外源木聚糖酶基因atx在水稻中的表达

 为通过在转基因植株中表达木聚糖酶来提高木聚糖酶的生产效率,将具有较高热稳定性和催化活性的杂合木聚糖酶基因atx连接到双元表达载体pCAMBIA1301上,成功构建了木聚糖酶植物表达载体atx Ru3ep 1301。然后以水稻成熟胚的愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将木聚糖酶基因导入水稻(中花11)中。经过潮霉素抗性检测和PCR鉴定,证实目的基因已经整合到转基因水稻基因组中。RT PCR分析结果显示,外源木聚糖酶基因能够在CaMV 35S启动子的引导下在转基因水稻中正常转录。转基因水稻能够正常生长和繁殖。木聚糖酶活性分析表明,转基因植株最高木聚糖酶活性约为4.37 U/g（鲜叶片）。因此,利用转基因水稻生产木聚糖酶将会是一种经济、有效的方法。     

叶绿体遗传转化技术的研究进展及应用于杂交水稻机械化制种的初步探索

叶绿体转化是继核转化之后在基因工程研究中出现的新热点。叶绿体转化具有表达高、可同时进行多基因转化、无基因沉默现象等许多优点。概述了植物叶绿体基因组特点、遗传转化技术原理以及最近研究进展,并对其应用于杂交水稻机械化制种做了初步探索。     

植物基因工程的新方向—叶绿体基因工程

叶绿体(质体)基因转化技术由于其独特的优越性,已开始成为植物基因工程中新的研究热点。本文就目前叶绿体基因工程进展及其应用作一简单的综述,涉及转化载体的构建、遗传转化系统、转化子的同质化和叶绿体基因工程的应用。     

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S:: BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol.L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55 mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。