猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及原核表达

【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

猪流产嗜性衣原体omp-1基因的重组质粒与重组蛋白免疫组合效果

为增强猪流产嗜性衣原体omp-1基因的免疫措施进而筛选出高效新型分子疫苗,本实验将猪流产嗜性衣原体omp-1基因克隆入pcDNA3.1( )载体构建DNA疫苗,初次和二次免疫分别以核酸/重组蛋白(DNA/r-MOMP)、重组蛋白/核酸(r-MOMP/DNA)、重组蛋白 核酸/重组蛋白 核酸(r-MOMP DNA/r-MOMP DNA)、核酸 核酸(DNA/DNA)和重组蛋白 重组蛋白(r-MOMP/r-MOMP)5种组合接种BALB/c小鼠,同时以载体和弱毒为对照。二次免疫后14 d以ELISA和T淋巴细胞增殖实验检测特异性体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示核酸与重组蛋白同时免疫可以诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,而DNA/r-MOMP组合的细胞免疫和体液免疫水平高于r-MOMP/DNA组合,单独免疫DNA组或r-MOMP都不能获得好的细胞和体液免疫。     

猪流产嗜性衣原体POMP90蛋白的原核表达及反应原性分析

设计特异性引物进行PCR扩增,获得猪流产嗜性衣原体CP/12株的pomp90基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-KG中.阳性重组质粒转化原核表达宿主菌E. coli BL21,用IPTG进行诱导表达,获得高效表达的融合蛋白.采用WeSTrn-blot和间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的反应原性,初步选择其最佳包被浓度为1μg/mL.     

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。     

鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白免疫肉鸡效果观察

利用鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白 (MOMP)在大肠杆菌中的表达产物 ,纯化后与白油佐剂乳化成疫苗。对 3批疫苗物理性状、无菌试验、安全试验、最小保护剂量、效力检验、免疫期、保存期和田间试验等各项技术指标进行了测定。重组MOMP疫苗为乳白色油包水型疫苗 ,黏度为 8s·0 4mL-1;细菌培养阴性 ;10d肉鸡分别以5 0和 10 0 μg注射免疫后 ,观察 14d ,免疫鸡群除一过性发蔫外 ,临床采食、饮水 ,注射部位剖检无异常变化 ;以 2 5 ,5 0 ,10 0和 2 0 0 μg分别免疫肉鸡后 ,30d龄攻毒 ,发现 5 0 μg免疫组可以抵抗病原的攻击 ;选择每只 5 0 μg免疫肉鸡 ,分别在 4 0 ,5 0和 6 0d攻毒 ,其保护率分别为 94 % ,95 %和 84 %。疫苗 2～ 8℃可储存 2 4 0d ,室温 ( 2 1～ 2 5℃ )、37℃不要超过 30d ;利用本疫苗免疫肉鸡 4 0 0 0 0只 ,保护率达 93% ,对照组为 85 %。本疫苗安全性高、保护率高、无副作用 ,能有效控制鹦鹉热衣原体的侵害。     

禽源衣原体主要外膜蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列设计合成1对引物,以禽源鹦鹉热衣原体基因组为模板,应用PCR扩增MOMP基因,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行序列分析。结果显示,本株禽源鹦鹉热衣原体MOMP编码基因全长为1176 bp,与国外报道的火鸡鹦鹉热衣原体TT3株的MOMP基因同源性为91.9%,与鹦鹉鹦鹉热衣原体6BC株MOMP基因的同源性为83.1%。     

羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络的构建

病原菌的相互作用组学研究是揭示潜在信号转导通路和新型药物靶标的有力工具。通过同源蛋白映射的方法构建了羊流产嗜性衣原体(Chlamydia abortus)的蛋白-蛋白相互作用网络。结果表明,所构建的互作网络包含220个蛋白和1 276个相互作用关系。通过分析蛋白的互作频率,确定了在羊流产嗜性衣原体中互作频率最高的20个蛋白,主要与转录、翻译、分子伴侣等功能相关。进一步分析发现,伴侣蛋白DnaK、GroEL、DnaJ发生互作的频率较高,能与核糖体蛋白、代谢相关蛋白等多种功能蛋白发生相互作用。若DnaK、GroEL、DnaJ的功能受到抑制,将会对羊流产嗜性衣原体的正常生命活动造成较大的影响。     

流产嗜性衣原体1B株pomp18基因β折叠区的克隆与表达

为探索POMP18蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用,本试验依据流产嗜性衣原体S26/3株全基因序列设计引物,用PCR法扩增流产衣原体pomp18基因β折叠区,将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体,测序比较分析序列后确认为目的基因,提交GenBank(Accession EU326104).与GenBank中流产嗜性农原体S26/3株的pomp18基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与其他各型衣原体代表株的相似性为79%～80%.将pomp18基因β折叠区亚克隆到pET-32a(+)表达载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果显示该重组菌表达了59 kD大小的融合蛋白;用羊流产嗜性衣原体多克隆抗体对表达的重组蛋白进行Western blotting试验,结果显示该重组蛋白具有免疫原性.本研究首次克隆、表达了流产衣原体pomp18基因β折叠区,原核表达获得了59 kD重组蛋白,为进一步探讨其生物学功能奠定基础.     

嗜水气单胞菌表层蛋白及外膜蛋白的初步分析

用甘氨酸缓冲液处理对鱼类致病的嗜水气单胞菌代表菌株 Ah J-1菌体细胞,可使该菌表层蛋白(S层)成片脱落。电镜观察发现,S 层是由四边形的蛋白亚单位呈晶格样排列而成。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,该蛋白的分子量约50k;免疫印迹显示,它是 Ah J-1的主要表面抗原。另将 Ah J-1用 Triton X-100选择性抽提,经 SDS-PAGE,在考马斯亮蓝染色图谱中显示其外膜蛋白(OMP)为3条主要蛋白带,分子量分别为34,46和58k.     

创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达

创伤弧菌是导致鳗鲡产生体表溃疡死亡的重要致病菌。本研究克隆了创伤弧菌FJ03-X2株外膜蛋白基因(ompU),构建含该基因的原核表达载体,命名为pET-32a-ompU,将其转化到大肠杆菌E.coli中进行融合表达。37℃,0.5mmol.L-1的IPTG诱导4h,融合蛋白rompU以可溶形式表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的rompU为与预期大小一致的单一条带。将纯化的rompU免疫SD级大鼠,ELISA检测收获的多克隆抗体血清效价,并通过Western-blot证实该OmpU多克隆抗体可以识别创伤弧菌FJ03-X2株中的天然外膜蛋白OmpU。     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达

OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。     

牛瑟氏泰勒虫P23主要表面蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达.[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆人pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆人表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌.通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性.[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008～1.000 mmol/L的IPTC对表达量的影响不大.Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性.[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础. Abstract： [Objective] The aim was to study cloning and prokaryotic expression of P23 major surface protein gene of Theileria sergenti.[Method]A pair of specific primers was designed according to the sequence of P23 major surface protein of T.sergenti (D84447).The P23 gene was amplified by PCR from genomic DNA of T.sergenti and cloned into pMD18-T vector to construct recombinant clonal vector pMD18-P23.Positive clones were identified by PCR screening and restriction digestion.A recombinant expression plasmid pGEX-4T-P23 was constructed by subcloning the cloned P23 gene into the linearized pGEX-4T-1 vector and transformed into E.coil BL21.After introduction by IPTG,the expressed fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western-blotting. [Result] The cloned gene has a total length of 507 bp.Sequencing result showed that the nucleotide sequence of the cloned P23 gene shared 99.4% identity with that of P23 published in GenBank (D64447).The expressed fusion protein was 46 ku in molecular mass.Induction opportunity of zhours after culture inoculation was the best,the induction time of 6 h was the best,and induction temperature of 34 ℃ was the best as well,IPTG of 1 mmol/L had little effect on the expression.Western-blotting indicated that recombinant protein was recognized by specific antibody. [Conclusion] This study would lay a foundation for further research on the prevention and diagnose of T,sergenti.     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

 【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis,HPS）外膜蛋白P5（outer-membrane protein P5,OMP5）,建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体 pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为 1:400,血清的最佳稀释度为1:160。用建立的间接ELISA 方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近。同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%。【结论】本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。     

牛瑟氏泰勒虫P23主要表面蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。     

临床分离鸡源性大肠杆菌外膜蛋白型的研究

[目的]了解禽致病性大肠杆菌分离株的遗传相关性。[方法]对分离自保定、秦皇岛和北京3个地区规模化养鸡场的病死鸡体内的38株大肠杆菌,采用超声波裂解和N-十二烷基肌胺酸钠进行外膜蛋白(Omp)提取,利用SDS-PAGE进行Omp分型。[结果]38株大肠杆菌共有3个Omp型,其中Omp-1型为O78、O88、O2、O18、O93、O766个血清型分离株所共有,Omp-Ⅱ型多为O76血清型分离株,Omp-Ⅲ型为O93、O78、O88、O2分离株所共有。这表明同一血清型的菌株可能属于完全不同的Omp型,而血清学上毫不相关的分离株之间却可具有相同的Omp型。[结论]该研究证实了同一血清型的分离株之间可发生遗传分化,而不同血清型的分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性。     

鸭疫里默氏杆菌中国分离株的外膜蛋白A基因的克隆与序列分析

为了对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)中国分离株的外膜蛋白A(OmpA)基因的序列进行分析,根据GenBank中已发表的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的外膜蛋白A(Om-pA)基因序列,在其高度保守区设计一对特异性引物,应用PCR技术,分别扩增从中国广东、福建和山东等地分离的8株鸭疫里默氏杆菌中国分离株的OmpA基因,克隆测序后与GenBank中已发表的26株鸭疫里默氏杆菌进行序列比较,结果表明:所有菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码387个氨基酸组成的蛋白质,起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高达88.2%~100%,氨基酸同源性达到88.9%~100%。试验表明,OmpA基因具有种内相对保守性,其核苷酸与氨基酸同源性与鸭疫里默氏杆菌的血清型、分离时间和地点之间无必然联系。     

副溶血性弧菌外膜蛋白的提取与免疫鉴定

[目的]为进一步确定致病性副溶弧菌共有的特异性抗原和保护性抗原奠定基础。[方法]通过小鼠毒力试验研究5株副溶血性弧菌菌株对小鼠的致病性,比较在不同培养基和培养时间下所提取的外膜蛋白的SDS-PAGE图谱并通过Western blotting分析研究副溶血性弧菌菌株的免疫原性。[结果]5株临床分离的副溶血性弧菌菌株明显对小鼠具有不同的致病性,同时能在兔血平板上形成明显的溶血圈,为TDH阳性菌株。通过菌体免疫获得的多克隆抗体,与除副溶血性弧菌外的其他试验菌株均无交叉反应。Western blotting分析显示该多克隆抗体与5株致病性副溶血弧菌菌株可发生程度不等的阳性反应,提取的外膜蛋白具有较好的免疫原性。[结论]该研究为制备有效预防副溶血性弧菌引起的疾病的菌苗提供了理论基础。