检测禽副粘病毒2型抗原的双抗体夹心ELISA方法的研究

以禽副粘病毒2型（Yucaipa株）群特异性单抗7E5为基础建立了检测PMV－2抗原的双抗体夹心ELISA方法。该方法对Yucaipa病毒的最低检出量为1．6962μg/ml，对PMV－2不同形式病毒及各分离株也都有很好的检出率。用Yucaipa病毒尿囊液人工感染10日龄SPF鸡，于感染后不同时间采集心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、气管等病科及泄殖腔拭子，经处理后用建立的方法进行检测，结果表明PMV－2病毒在感染鸡的法氏囊组织内大量存在，感染后3天就可从法氏囊组织内检测到PMV－2病毒，粪便中仅个别有检出阳性者。     

禽副粘病毒2型(PMV-2)群特异性单克隆抗体的研究

禽副粘病毒2型（Yucaipa株）鸡胚成纤维细胞适应毒经差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯，免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA方法筛选，有限稀释3次克隆，获得了两株分泌PMV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E9和7E5。经鉴定两株单抗均为IgG1亚类，杂交瘤细胞的平均染色体分别为96条和98条。细胞培养上清及腹水效价分别为1：25600、1：25600、1：51200和1：10^5、1:10^7。6E9和7E5单抗能稳定分泌抗体且与NDV、AIV、EDSV无交叉反应。间接ELISA实验表明4株PMV-2（Yucaipa株、F4株、F6株和F8株）均含有单抗6E9和7E5所针对的位点。     

禽副粘病毒2型(PMV-2)致病性的研究

7日龄SPF鸡经滴鼻、点眼感染PMV-2，可引起轻微的呼吸道症状，病理组织学观察可见气管粘液分泌亢进和少量的淋巴细胞浸润。PMV-2与传染性支气管炎（IBV）或鸡毒支原体（MG）协同感染比单纯感染这三种病原的任何一种均呈现更严重的呼吸道症状，病理组织变化呈气管纤毛部分或全部脱落，气管粘膜上皮细胞不同程度的变性、脱落。固有层和粘膜下层严重水肿，有大量淋巴细胞、巨噬细胞和异嗜细胞浸润。SPF雏鸡感染PMV-2后的不同时间检查病毒在鸡体内的分布规律，结果表明，PMV-2在法氏囊中大量分布；气管、肺、胸腺中有较多病毒；大脑、脾和肾脏只有少量病毒存在。上述实验结果揭示PMV-2感染SPF雏鸡致病性较弱，PMV-2在鸡呼吸道综合征中起一定作用。     

禽副粘病毒2型对SPF鸡免疫功能的影响

7日龄 SPF鸡经滴鼻、点眼感染 PMV- 2 ,可引起轻微的呼吸道症状 ,病理组织学观察可见气管黏液分泌亢进和轻微的淋巴细胞浸润 ;感染 PMV- 2后的 1天 ,2天 ,3天… 11天 ,定位采取气管、肺、肝、脾、肾、心、大脑、法氏囊、盲肠扁桃体等组织 ,检查病毒的分布规律 ,结果表明 ,PMV- 2在法氏囊、气管、肺、胸腺、脾、肾、大脑中均有分布 ;SPF雏鸡感染 PMV - 2后 ,接种鸡新城疫克隆 30疫苗 ,免疫后 5 - 30天 ,每 5天 1次检测血清中 ND的 HI抗体效价 ,结果表明 ,PMV- 2感染组比对照组的 HI抗体效价平均低 2 log2 ,统计结果显示差异极显著。雏鸡感染 PMV - 2后对新城疫疫苗的免疫应答有影响 ,从而可能抑制机体的免疫功能 ,危害养鸡生产。     

新城疫病毒(禽Ⅰ型副粘病毒)的检测和鉴别

新城疫病毒（NDV）分离株毒力的巨大差异使得检测DNV对于确诊该病是远远不够充分的，因为无致病力的病毒和有毒力的毒株所采取的控制措施是大不相同的。因此诊断需要更多的证据，至少要能够说明所分离的毒株是否具有毒力。常规的检测和鉴别NDV方法通常费时费力，并需要非常烦琐的体内试验。此外，进一步的诊断还需要提供更多有关于来源及其传播的信息。本文集中讨论了单克隆抗体技术和分子生物学技术在诊断该病上的应用。尽管对NDV分离株的毒力验证仍需进行体内试验，一套套单克隆抗体株的建立和应用对于鉴定DNV分离株来说仍是一个巨大进步。由于分子生物学技术变得更加简便可靠，极有可能取代单抗的应用，尤其是那些为了流病学目的而对病毒所作的鉴定。分子生物学技术的诱人之处在于其可以快速、精确而肯定地在一个试验中同时囊括诊断新城疫（ND）的三个方面：病毒的检测、鉴定（包括对其毒力的检测）和流行病学。大量基于RT－PCR的技术已被建立起来，同时辅以其后的酶切分析、核酸探针杂交以及核酸测序技术。尽管NDV各毒株之间的广泛变异仍然造成了一些技术困难，但分子生物学技术对于诊断ND的实在而潜在的优势仍使其应用前景十分广阔。     

鸽的禽Ⅰ型副粘病毒特性及其免疫的研究

鸽的禽Ⅰ型副粘病毒特性及其免疫的研究李柠，黄引贤（华南农业大学动物医学系，广东广州５１０６４２）鸽的禽Ｉ型副粘病毒（Ａ／ＰＭＶ－１）感染在世界各国广泛流行，我国许多省市目前也暴发流行本病。不少学者对鸽Ａ／ＰＭＶ－１进行了大量的研究，证实了鸽的Ａ／ＰＭ...     

猪O型口蹄疫3种抗体检测方法的比较

用液相阻断ELISA、正向间接血凝试验、VP1结构蛋白ELISA3种抗体检测方法同时检测来自全国10个省25个规模猪场、18个屠宰场及散养户的937份猪血清中的O型口蹄疫抗体。结果表明,这3种方法检测的抗体阳性率分别为75.9%、81.8%和62%。与液相阻断ELISA相比,正向间接血凝试验比VP1结构蛋白ELISA的符合率高,前者的敏感性为94.9%,特异性为59.3%,后者的敏感性为75.2%,特异性为79.6%。研究为猪O型口蹄疫免疫抗体监测工作的实施提供了较好的参考。     

不同方法对夏南牛口蹄疫免疫抗体水平检测的比对试验

[目的]为探索中小规模养牛场自繁自育条件下,繁殖母牛(指经产1胎以上的母牛,下同)、断奶犊牛(指4月龄以上的犊牛,下同)口蹄疫适宜的免疫时间,检测口蹄疫免疫的效果,为中小规模养牛场制定科学的口蹄疫免疫程序提供参考数据,开展本试验。[方法]采用液相阻断ELISA、固相竞争ELISA两种检测方法进行比对试验。[结果]采用液相阻断ELISA试验结果显示:繁殖母牛抗体效价,在免疫后30 d,60 d,90 d和120 d时免疫抗体合格率分别为65.6%,87.5%,78.1%和46.8%;断奶犊牛在免疫后10 d,40 d,70 d,100 d时免疫抗体合格率分别为75%,100%,83.3%,41.6%。采用固相竞争ELISA试验结果显示:繁殖母牛抗体效价,在免疫后30 d,60 d,90 d,120 d时免疫抗体合格性率分别为78.1%,100%,100%,75%;断奶犊牛在免疫后10 d,40 d,70 d,100 d时免疫抗体合格率分别为83.3%,100%,100%,75%。[结论]从试验结果来看,固相竞争ELISA试验检测只能判定结果是抗体阳性、或抗体阴性,试验操作简单方便,结果判定也容易辨别,但与液相阻断ELISA试验结果相比,抗体水平检测有一定的误差。     

以免疫纳米微球为凝集原的犬细小病毒2型抗体凝集检测方法的建立

为建立以红色聚苯乙烯纳米微球为载体的犬细小病毒(CPV)抗体检测的间接凝集方法,本研究表达纯化了CPV-2VP2截短的重组蛋白rsVP2,并以rsVP2为致敏原与纳米微球偶联制备了免疫彩色纳米微球;通过对反应条件的优化,建立了一种快速检测CPV-2抗体的间接凝集方法。特异性试验结果显示,致敏微球仅与CPV-2阳性血清发生凝集反应,不与犬瘟热病毒、狂犬病病毒和犬腺病毒的阳性血清发生凝聚反应,特异性强;该凝集方法检测血清中和抗体的最低效价为1∶256;同一批次制备的3份致敏微球、3个不同批次制备的致敏微球以及4℃保存90d的致敏微球与CPV-2阳性血清的凝集反应特异性一致,凝集程度无明显差异,重复性稳定性均较好。该间接凝集检测方法对40份血清样品的检测结果与ImmunoComb■ Canine VacciCheck试剂盒(Dot-ELISA)检测结果的阳性符合率为97%。本研究建立的间接凝集方法为幼犬CPV-2母源抗体或免疫犬CPV-2抗体检测提供了一种快速、简便、准确、经济的方法。     

阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。     

Establishment and application of a solid-phase blocking ELISA method for detection of antibodies against classical swine fever virus

BackgroundClassical swine fever (CSF) is a severe infectious disease of pigs that causes significant economic losses to the swine industry.ObjectivesThis study developed a solid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay (spbELISA) method for the specific detection of antibodies against the CSF virus (CSFV) in porcine serum samples.MethodsA spbELISA method was developed based on the recombinant E2 expressed in Escherichia coli. The specificity of this established spbELISA method was evaluated using reference serum samples positive for antibodies against other common infectious diseases. The stability and sensitivity were evaluated using an accelerated thermostability test.ResultsThe spbELISA successfully detected the antibody levels in swine vaccinated with the C-strain of CSFV. In addition, the detection ability of spbELISA for CSFV antibodies was compared with that of other commercial ELISA kits and validated using an indirect immunofluorescence assay. The results suggested that the spbELISA provides an alternative, stable, and rapid serological detection method suitable for the large-scale screening of CSFV serum antibodies.ConclusionsThe spbELISA has practical applications in assessing the vaccination status of large pig herds.     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）,用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%（52/56）,对照组猪血清抗体检测均为阴性（33/33）。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。     

鸡白细胞介素2分子单克隆抗体的研制

以含有鸡白细胞介素2（ChlL-2）基因的重组真核表达质粒pcDNA3．1-ChlL-2免疫6周龄BALB／c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。共获得2株特异性分泌抗鸡IL-2分子的杂交瘤细胞株,分别命名为1H10和1E6,其腹水ELISA效价分别为1：6400和1：3200,亚类鉴定结果均为IgM。重组质粒pcDNA3．1-ChlL-2转染COS-7细胞,以上述单克隆抗体（mAb）检测表达产物,结果表明,2株mAb均能与表达产物反应;Western blot分析结果显示,2株mAb均与原核表达鸡IL-2蛋白发生特异性反应。本研究所制备的抗鸡IL-2分子mAb可为建立简单、快速的鸡IL-2检测方法提供可能,并为鸡IL-2生物学特性和禽类细胞免疫机理的研究提供材料。     

广西不同年龄猪群中2型猪链球菌抗体水平调查分析

为调查规模化猪场不同年龄猪群中2型猪链球菌(S.suis 2)抗体水平,本研究采用以荚膜多糖为抗原的间接ELISA对来自广西地区母猪群、肥猪群、生长猪群共1 908份血清样品进行了S.suis 2抗体检测和分析。结果显示:成年猪群中抗S.suis 2的抗体水平普遍较高,种猪场母猪血清抗体阳性率可高达95%以上,不同地区屠宰场的育肥猪血清抗体阳性率在39.2%~97.5%。对不同日龄仔猪群抗体水平检测分析显示:14日龄~42日龄期间,抗体水平随仔猪日龄的增长而呈逐渐下降的趋势;而42日龄~130日龄期间,抗体水平随日龄的增长而呈逐渐上升的趋势。此外,经产母猪群抗体水平略高于后备母猪群,并且随胎次的增加,抗体的离散度缩小。以上结果表明S.suis 2抗体在仔猪生长阶段的空白期即42日龄时,仔猪群抗体水平最低。因此,在这个阶段和之前做好S.suis的预防和免疫工作对猪群链球菌病的防控至关重要。     

抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。     

重组M蛋白-乳胶凝集试验检测PRRS病毒血清抗体的研究

利用纯化的 PRRS病毒重组 M蛋白致敏乳胶制成乳胶抗原 ,成功地建立了一种检测 PRRS病毒血清抗体的乳胶凝集试验 (L AT)诊断方法。用制备的乳胶 M抗原分别检测猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪弓形体病、猪衣原体病、猪乙型脑炎阳性血清 ,结果均为阴性 ,无交叉反应 ,说明建立的 L AT方法具有良好的特异性。用建立的乳胶凝集试验方法与国外IDEXX公司 PRRS病毒抗体检测试剂盒同时对 76份猪血清样本进行检测 ,结果表明建立的 L AT方法的特异性和敏感性均为 95 % ,两种方法的总符合率为 87% ,检出率基本一致。研究结果表明 L AT方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点 ,是一种适合基层兽医单位用于 PRRS病毒血清抗体检测的新方法