抑制南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白P5-1的表达阻碍病毒在昆虫体内的增殖

为明确南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)编码的非结构蛋白P5-1参于SRBSDV在介体白背飞虱体内侵染过程中的作用机制,通过原核表达蛋白制备SRBSDV编码的非结构蛋白P5-1的多克隆抗体,并应用Western blot和免疫荧光标记法检测抗体的特异性,以注射法将来源于P5-1基因的dsRNA(ds P5-1)注入获毒1 d的白背飞虱体内,5 d后通过免疫荧光标记法检测ds P5-1对SRBSDV在白背飞虱体内增殖的影响,同时以注射来源于GFP基因的dsRNA(ds GFP)为对照。结果显示,Western blot和免疫荧光标记分别检测到SRBSDV侵染水稻和白背飞虱表达的P5-1蛋白,表明所制备的P5-1抗体具有特异性。ds GFP处理的对照组白背飞虱带毒率高达81%,而ds P5-1处理的白背飞虱带毒率仅为21%,且P5-1蛋白的表达和SRBSDV在昆虫体内的增殖均受到抑制。表明P5-1蛋白是病毒在昆虫体内增殖的关键因子,可作为阻断病毒在昆虫体内增殖的理想靶标。     

Biology of Southern rice black‐streaked dwarf virus: a novel fijivirus emerging in East Asia

Southern rice black‐streaked dwarf virus (SRBSDV) was first reported in southern China in 2001 and causes a striking disease on rice and maize that leads to serious yield losses in several East Asian countries, such as China, Vietnam and Japan. A large research effort has been directed to understanding the virus and controlling the disease. Its geographic distribution, disease cycle via its insect vector, genome organization, relationship with host plants, and epidemiology are summarized in this review and the important role played by the vector, the white‐backed planthopper (Sogatella furcifera), is emphasized. Countermeasures to control the disease that have been developed and applied include molecular detection for precise forecasting, chemical, physical, and ecological pest management. There is widespread insecticide resistance in the vector population but it is hoped that current efforts to develop rice cultivars resistant to the virus will eventually provide effective and cost‐effective control.     

水稻OsAGO家族成员特征及对RGDV和SRBSDV的响应

为初步探究OsAGO家族在水稻抗病毒通路中的功能,对水稻OsAGO蛋白的基因组结构、系统发育关系、氨基酸序列及水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus,RGDV）和南方水稻黑条矮缩病毒（southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV）侵染后的转录组数据进行分析,同时采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）技术对这2种病毒侵染后OsAGO基因的相对表达量变化进行验证。结果表明,19个水稻OsAGO蛋白的外显子数量、内含子数量及编码区长度存在较大差异,且这19个OsAGO蛋白均匀分布在3个分支中;OsAGO蛋白PAZ结构域中与小RNA结合相关的YF（酪氨酸-苯丙氨酸）基序在OsAGO₂、OsAGO3和OsAGO5中变成了YY（酪氨酸-酪氨酸）,OsAGO蛋白PIWI结构域中与OsAGO蛋白切割活性相关的DDX（X代表H或D,即天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸/天冬氨酸）基序在OsAGO13中替换为LDH（亮氨酸-天冬氨酸-组氨酸）基序,而在OsAGO17中不包含YF基序且DDX基序替换为HDR（组氨酸-天冬氨酸-精氨酸）基序。RGDV侵染后OsAGO5和OsAGO12基因的转录组分析结果与qPCR结果一致,其中OsAGO5上调表达,OsAGO12下调表达;SRBSDV侵染后OsAGO1a、OsAGO1b、OsAGO1c、OsAGO1d和OsAGO4b基因的转录组分析结果与qPCR结果一致,均上调表达。表明大多数OsAGO均能响应RGDV和SRBSDV的侵染。     

南方水稻黑条矮缩病研究进展

南方水稻黑条矮缩病是21世纪初在我国华南地区首先发现的经远距离迁飞性害虫白背飞虱Sogatella furcifera传播的一种新的水稻病毒病,在发现后的十多年间发生面积不断扩大,危害逐年加重,成为我国和越南及周边国家重要水稻病害。迄今,有关该病害的研究取得了显著进展,本文综述了该病害的发生历史、病原特征及致病机理、病毒传播及流行规律和测报及防控技术,以期为该病害的深入研究和持久控制提供参考。     

南方水稻黑条矮缩病防控药剂的创制与应用

南方水稻黑条矮缩病是我国及越南等东南亚国家稻区水稻的重要病毒病。该病害潜隐性强、危害重、防控难度大,对水稻生成构成极大威胁。本文综述了南方水稻黑条矮缩病毒的基因组结构及功能、分子进化、病毒与植物寄主或媒介昆虫间的互作、测报技术、药剂创制和田间综合防控的研究进展,并对未来工作进行了展望与讨论。     

Effects of sublethal concentrations of deltamethrin on fitness of white-backed planthopper,Sogatella furcifera (Horváth)

Sogatella furcifera (Horváth) is one of the most important migratory pests of rice in Asia. When normal concentrations of deltamethrin are applied to control lepidopteran pests of rice in the field, it is likely that S. furcifera will be exposed to sublethal concentrations of this chemical. Therefore, we examined the sublethal effects of deltamethrin on the development and reproduction of S. furcifera using the rice stem dipping method. The results showed that exposure of 3rd instar S. furcifera to LC₁₀ and LC₂₅ deltamethrin significantly increased the emergence rates compared with the F₀ generation control group, but there was no significant difference in the nymphal stage duration, adult longevity and female fecundity. Nymphal duration of the F₁ generation was significantly prolonged under both treatments. Female fecundity also increased in this generation, with a significant difference between the LC₂₅ treatment group and controls. The relative fitness of the LC₁₀ and LC₂₅ treatment groups was 0.84 and 0.80, respectively. The results showed that sublethal concentrations of deltamethrin stimulate the reproduction of S. furcifera, but decrease the relative fitness of the population. These results provided a reference point for the application of insecticides to control S. furcifera.     

杀虫剂对转Bt水稻靶标害虫二化螟和非靶标害虫稻飞虱种群数量的影响

为明确杀虫剂对转Bt水稻品种华恢1号(Huahui 1,HH1)靶标害虫二化螟Chilo suppressalis及其非靶标害虫白背飞虱Sogatella furcifera和褐飞虱Nilaparvata lugens种群数量的影响,于2014—2015年在江西省南昌市南昌县莲塘镇的广福试验基地进行田间试验,种植转Bt水稻和对照亲本水稻,分别对其进行施用杀虫剂和未施用杀虫剂处理,然后对经2种处理后转Bt水稻和对照亲本水稻田中靶标害虫二化螟幼虫数量及非靶标害虫白背飞虱、褐飞虱的若虫数量、成虫数量、总虫量(若虫数量和成虫数量之和)进行调查,并对这3种害虫田间种群数量的年份、水稻品种、杀虫剂影响因子进行方差分析。结果显示,转Bt水稻种植对二化螟幼虫数量影响显著,而施用杀虫剂处理未显著影响二化螟幼虫数量。转Bt水稻种植对白背飞虱和褐飞虱的若虫数量、成虫数量和总虫量无显著影响;而施用杀虫剂处理显著降低转Bt水稻及其对照亲本水稻稻田内白背飞虱和褐飞虱的若虫数量及总虫量,并显著降低白背飞虱成虫数量。2014年和2015年,施用杀虫剂和未施用杀虫剂转Bt水稻田内二化螟幼虫数量极低或未调查到;未施用杀虫剂转Bt水稻上二化螟幼虫数量仅在2014年显著低于未施用杀虫剂对照亲本水稻。2014年,未施用杀虫剂转Bt水稻和对照亲本水稻上白背飞虱总虫量最大值分别为1 037、1 376头/百丛,施用杀虫剂后分别降低至233、253头/百丛;未施用杀虫剂转Bt水稻上和对照亲本水稻上褐飞虱总虫量最大值分别为4 120、2 413头/百丛,施用杀虫剂后降低至367、410头/百丛;2015年白背飞虱和褐飞虱的发生规律与2014年相同。表明转Bt水稻可显著降低二化螟幼虫数量,但褐飞虱及白背飞虱数量没有降低,而施用杀虫剂可有效降低褐飞虱及白背飞虱数量。     

南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较

为明确南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）检测方法的最佳适用范围,对其现有检测方法Real time RT-PCR、RT-LAMP、RT-PCR的灵敏性及特异性进行了比较,并分析了依据SRBSDV单克隆抗体3F1建立的斑点免疫结合印迹（dot immunobinding assay, DIBA）方法对检测植物寄主和白背飞虱Sogatella furcifera Horvth的特异性。结果表明,灵敏性以Real time RT-PCR方法最高,其次为RT-LAMP方法,而普通RT-PCR方法相对较低。这3种方法均可特异性检测SRBSDV植物寄主和白背飞虱;DIBA方法可以满足SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV）植物寄主和白背飞虱大量样品的检测,但不能区分SRBSDV和RBSDV。Real time RT-PCR方法实现了短时间内对SRBSDV RNA拷贝数的相对定量;RT-LAMP方法全程恒温反应,无需热循环仪。     

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni~(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。     

溴氰虫酰胺对白背飞虱室内敏感种群的亚致死效应

为探究溴氰虫酰胺对白背飞虱的亚致死效应,采用稻茎浸渍法,分别以LC10和LC25浓度的溴氰虫酰胺胁迫白背飞虱3龄若虫,观察受胁迫后试虫发育历期、产卵量和雌虫寿命的变化情况,并组建了其F1代种群的特定时间生命表。结果表明:经LC10和LC25浓度溴氰虫酰胺胁迫后,F0代白背飞虱单雌产卵量与对照相比差异显著,分别减少了40.41%和41.36%;F1代雌虫比例（Fr）及孵化率（Ha）与对照相比差异不显著,但其繁殖力（Fd）比对照组分别降低了14.41%和16.31%,预测的后代数量（N）及种群增长趋势指数（I）也均低于对照组。经溴氰虫酰胺LC10和LC25浓度处理后,白背飞虱的相对适合度分别为0.78和0.64。根据研究结果推测,在田间施用溴氰虫酰胺防治水稻害虫时,不仅对当代白背飞虱有致死效应,对其后代种群的增长也有一定的抑制作用。     

南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒的单抗制备及其检测应用

 用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）衣壳蛋白的C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株3F1、5G1。3F1、5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6,抗体类型及亚类均为IgG1, kappa链。 Western blot分析表明,2株单克隆抗体均与SRBSDV和RBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用单克隆抗体3F1建立的dot-ELISA检测方法能准确、特异、灵敏地检测田间稻飞虱及水稻样品中的SRBSDV和RBSDV。SRBSDV和RBSDV单克隆抗体的制备及检测方法的建立为水稻黑条矮缩病的诊断、预测预报及科学防控提供了技术支撑。     

2011-2012年三种水稻矮缩病在我国的分布及发生调查

水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒均可以引起水稻矮缩病。于2011-2012年,利用dot-ELISA和RT-PCR方法对江苏、浙江、江西、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、湖南等省的水稻矮缩病进行调查。检测结果表明,2011年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒10.92%,南方水稻黑条矮缩病毒30.67%,水稻齿叶矮缩病毒4.62%。2012年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒0.40%,南方水稻黑条矮缩病毒48.38%,水稻齿叶矮缩病毒26.32%。检测结果说明2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害重于2011年,水稻黑条矮缩病害轻于2011年。水稻黑条矮缩病主要发生于江苏、浙江等省;南方水稻黑条矮缩病主要在广西、海南、云南、贵州、重庆、浙江等省区流行;水稻齿叶矮缩病在广西、海南、云南等地均有发生,且往往与南方水稻黑条矮缩病毒复合感染。     

水稻苗期感染SRBSDV后赤霉素相关基因表达量及赤霉素含量的变化

为明确水稻在苗期被南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)浸染后植株体内赤霉素合成相关基因表达量和赤霉素含量的变化情况,利用q RT-PCR技术检测水稻在3叶期感染SRBSDV后的5个时期Os01g0883800、Os03g0856700、Os07g0169700三个赤霉素的生物合成基因表达量;采用高效液相色谱法检测GH998和Y11植株感染SRBSDV后的赤霉素含量;观察GH998病株施用外源赤霉素后病症的缓解效果。结果表明,感染SRBSDV后在GH998叶片中,以在第0天为对照组,Os01g0883800和Os07g0169700相对表达量最大分别下调25.6倍和21.1倍,Os03g0856700在第3天相对表达量下调20.5倍,在第6天上调2.3倍;在茎中,Os01g0883800、Os07g0169700、Os03g0856700的相对表达量在第3天分别下调8.5倍、6.4倍和1.4倍。在Y11叶片中Os01g0883800、Os03g0856700和Os07g0169700相对表达量最大下调分别为6.6倍,42.7倍和16.9倍;在茎中,Os01g0883800、Os07g0169700相对表达量最大下调分别为5.3倍和10.5倍;Os03g0856700在第3天时表达量上调1.5倍,在第12天下调2.8倍。GH998感染SRBSDV后植株体内赤霉素含量显著降低;施用外源赤霉素能缓解SRBSDV部分病症,表现为株高、剑叶长、剑叶宽和根长等均增加。     

白背飞虱VAMP7和Vti1a蛋白的原核表达、抗体制备及应用

白背飞虱Sogatella furcifera的囊泡相关膜蛋白7(VAMP7)和囊泡转运蛋白(Vti1a)隶属于SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)家族,该家族蛋白主要参与生物体中关键的膜转运过程。前期研究发现这两种蛋白分别与南方水稻黑条矮缩病毒Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV)的主要外层衣壳蛋白P10存在显著互作,推测可能协助病毒粒体在介体白背飞虱内的转运和扩散。为了进一步利用血清学技术研究VAMP7和Vti1a在传毒过程中的功能,本研究克隆了白背飞虱编码这两种蛋白的基因,成功构建了VAMP7和Vti1a基因的原核表达载体,并将载体分别转入大肠杆菌中进行诱导表达,得到了相应的原核表达蛋白。在蛋白纯化后,将纯化蛋白注射于新西兰大白兔体内进行免疫,分别制备得到VAMP7和Vti1a的抗体。两种抗体经Western blot检测发现,均可分别与白背飞虱体内的VAMP7和Vti1a特异性结合。利用制备的抗体对白背飞虱的肠道进行免疫标记,激光共聚焦显微镜观察发现所制备抗体能够在白背飞虱中肠上皮细胞的胞质中特异性标记到VAMP7和Vti1a,表明制备的抗体能够成功用于这两种蛋白的体内外检测,为阐明这两种蛋白参与传播SRBSDV的机制研究奠定了基础。     

南方水稻黑条矮缩病毒一步双重RT-PCR 检测技术及其应用

 An one-step dual RT-PCR method was developed for Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) detection from host plants and insect vector white-backed planthopper (Sogatella furcifera Horvath,Hemiptera: Delphacidae), from which two cDNA fragments of the viral genome S5 and S10 were amplified
simultaneously. Two primer pairs, S5-F1 / S5-R2 (5′-ttacaactggagaagcattaacacg-3′ / 5′-atgaggtattgcgtaactgagcc -3′) and S10-oF / S10-oR(5cgcgtcatctcaaactacag -3′ / 5′-tttgtcagcatctaaagcgc -3′), were selectedfrom 40 primer pairs based on SRBSDV genome sequences, and amplified viral S5 ORF1 fragment (819 bp) and cp gene fragment ( 682 bp), respectively. Using total RNA extracts from infected plant leaf tissue or individual planthopper adult as templates, one step RT-PCR reaction in the conditions of annealing temperature of 53℃ with the final concentrations of 240 nmol / L S5-F1 / S5-R2 and 120 nmol / L S10-oF / S10-oR generated a similar yield of two amplicons in argrose electrophoresis analysis. Sequence analysis confirmed the correct
result of the amplification. Additionally, several commercal RNA extraction kits was proven to be fit for the template preparation, and the protocol for total RNA extraction from plant leaf tissue and individual planthopper was simplified by sample grinding direct in eppendorf tube. This method can be used for SRBSDV detection of dried or 70% alcochol soaked planthopper samples stored over one month in room temprature. Key words: Southern rice black-streaked dwarf virus; Sogatella furcifera Horvath     

水稻病毒与植物寄主互作研究新进展

水稻是维持世界一半以上人口生存的主要粮食作物,其产量和品质关系到社会稳定。近年来,水稻病毒引起的病毒病严重影响作物的产量及品质。植物在与病毒长期的互作过程中进化出了多种有效的防御机制来抑制病毒侵染。本文围绕近年来国内外关于水稻抗病毒的研究进展,对植物激素、自噬与水稻病毒的互作关系进行总结,并提出了水稻病毒研究过程中所涉及到的一些问题,以期为开展水稻抗病育种相关研究提供参考。     

云南低热河谷地区冬季稻飞虱传播的水稻病毒病调查及防治建议

于2012年2月对云南低热河谷地区施甸县、元江县玉米、水稻、黑麦草和稻飞虱调查及样本检测,结果显示,白背飞虱携带南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),褐飞虱携带水稻齿叶矮缩病毒(RRSV),再生稻感染SRBSDV、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和RRSV,水稻秧苗感染SRBSDV.玉米SRBSDV发病面积占种植面积的36.81％.云南低热河谷地区越冬稻飞虱是早春水稻、玉米病毒病传播的重要介体,再生稻、秧苗、玉米是病毒冬季存续循环的重要寄主和初始毒源.改秋冬种玉米为蔬菜,或推迟玉米播期,晚稻收割后及时翻耕,晚稻收割后至玉米播种期间有1个月以上的空田期,物理阻隔育秧或异地育秧,是切断病毒冬季循环的重要措施.     

白背飞虱群体接毒条件的优化及抗病毒药剂对南方水稻黑条矮缩病的防效

为比较氨基寡糖素等抗病毒诱导剂和嘧肽霉素等抗病毒剂对南方水稻黑条矮缩病的防效,从稻苗生育期、饲毒与接毒时间等方面优化白背飞虱群体接毒条件,对不同药剂处理的稻苗进行人工接毒,并分别于接毒前后喷施抗病毒诱导剂和抗病毒剂,比较不同药剂防效的差异。结果显示,3叶1心期稻苗分别饲毒与接毒12 h较适合室内白背飞虱的群体接毒。抗病毒诱导剂中,100 mg/kg氨基寡糖素和60 mg/kg超敏蛋白的效果较好,病情指数分别为54.86和52.86,防效分别为22.17%和24.99%。抗病毒剂中,240 mg/kg嘧肽霉素的效果较好,病情指数为50.95,防效为28.67%;其次为120 mg/kg嘧肽霉素和600 mg/kg毒氟磷,病情指数分别为55.71和59.05,防效为22.00%和17.34%。     

Characterization of mutants of the chestnut blight fungus (<Emphasis Type="Italic">Cryphonectria parasitica</Emphasis>) with unusual hypovirus symptoms

The type virus of the family Hypoviridae, Cryphonectria hypovirus 1 strain EP713 (CHV1-EP713), infects Cryphonectria parasitica, the filamentous causal fungus of chestnut blight, and reduces its virulence. This pathosystem serves as a model to study fungus-mycovirus interactions. We previously developed a genetic screening protocol for host factors associated with symptom induction by CHV1-EP713 and its mutants. In the procedure the standard field fungal isolate EP155 was transformed by cDNA from a mild hypovirus mutant Cys(72), launching virus infection, and mutagenized by random plasmid insertion with pHygR conferring hygromycin resistance. We now report an extension of the study to characterize different mutant strains, with different phenotypes than their parental strain TCys(72)-1. TCys(72)-1 is moderately reduced in pigmentation and sporulation compared to the uninfected wild-type strain EP155. Mutants sfb1, sfb2 and k202 were characterized biologically and molecularly in comparison to the previously isolated mutant (namA) and the parental strain. These mutants harbored one (sfb1) or more copies (sfb2 and k202) of the mutagenic plasmid, pHygR. The three mutants had similar biological attributes; that is, vegetative growth rate, conidiation and virulence (assay on apples) was reduced on potato dextrose agar media, relative to the parental strain and pigmentation was the same or slightly increased. Interestingly, viral dsRNA accumulation levels were apparently unaltered in these mutants. The screening method was efficient for mining fungal mutants with unusual hypovirus symptoms. Further, characterization of the mutants provides interesting insights into symptom induction by the hypovirus.     

四川省东部稻区稻飞虱种群动态分析

为明确四川省东部稻区稻飞虱的发生情况及规律,于2014—2018年通过灯光诱捕和田间调查的方法,以达州市达川区、大竹县和泸州市叙永县稻区为代表对川东稻区稻飞虱种群进行系统调查。结果显示:川东稻区稻飞虱优势种为白背飞虱Sogatella furcifera。灯诱条件下川东南稻区叙永县稻飞虱始见期为5月上中旬,川东北稻区达川区和大竹县稻飞虱始见期为5月底至6月上中旬;高峰期均为7月中旬至8月上旬。2014—2018年达川区、大竹县和叙永县稻区稻飞虱田间发生最严重的年份分别为2018、2014和2018年,该年田间发生总量分别为29 946、15 353和35 607头/百丛。川东南稻区稻飞虱为害中若虫数量占绝对优势,但成虫发生为害持续时间长;在达川区、大竹县和叙永县稻区稻飞虱发生最严重的年份,成虫的田间发生量分别达到4 583、5 452和16 870头/百丛。川东稻区稻飞虱整体上在2014年和2017—2018年间发生较重,且川东南稻区害虫发生较川东北稻区更严重。表明四川省东部3个稻区稻飞虱的发生量在不同年份间有很大差异,且优势种为白背飞虱,其成虫持续为害时间长。