茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树重要功能基因克隆研究进展

根据发表的文章以及对美国生物技术信息中心（NCBI）的检索结果,从茶树儿茶素类代谢相关基因、咖啡碱代谢相关基因、茶香气形成相关基因等方面介绍茶树重要功能基因分离研究进展。     

茶树cpDNA测序及基于cpDNA序列的山茶属植物亲缘关系研究

叶绿体基因组在物种鉴定、系统进化分析及亲缘关系研究等领域应用前景广阔。本文应用Illumina高通量测序技术对龙井43（Camellia sinensis cv. Longjing 43）的叶绿体全基因组进行测序;利用叶绿体trnL-trnF序列研究茶树及其近缘植物的亲缘关系。结果表明,龙井43叶绿体基因组全长为157 096 bp,反向互补重复区（Inverted repeat, IR）为26 080 bp,小单拷贝区（Small single copy region, SSC）、大单拷贝区（Large single copy region, LSC）分别为18 283 bp、86 653 bp。共注释叶绿体基因133个,其中蛋白编码基因86个,rRNA基因8个,tRNA基因39个。对所选植物的trnL-trnF序列进行比对,序列长度变异范围为481~501 bp,序列最长为岔河大茶,最短为金花茶,基于此序列构建亲缘关系树,山茶属茶组植物聚成一个组。研究结果对茶树优良品种培育及山茶属植物亲缘关系的研究具有重要价值。     

中国水仙查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是影响类黄酮合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从中国水仙的花瓣中克隆得到3条CHI基因,分别命名为NtCHIW、NtCHIJ和NtCHIY.3个基因均含有一个735 bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸.氨基酸序列分析表明:白花水仙与金...     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi）,是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′ RACE和5′ RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014 bp,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。     

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因 HhMVD 的克隆与表达 分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD）是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶, 为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过 RT-PCR 和 RACE 技术从洋常春藤叶片中克隆获得 HhMVD 基因的 cDNA 全 长序列,并通过 RT-qPCR 技术分析其表达规律。结果表明：RACE 克隆获得的 HhMVD 基因 cDNA 序列全长 1 799 bp, 包含一个完整开放阅读框（ORF）1 263 bp、5′非编码区（5′UTR）192 bp、3′非编码区（3′UTR）344 bp;该基因编码 420 个氨基酸,分子质量 46.6 ku,理论等电点为 6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD 蛋白具有 GHMP 激 酶 N 端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR 结果表明,洋常 春藤中 HhMVD 基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤 HhMVD 基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。     

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸（Vc）是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP cDNA全长序列,共计1510βbp,其中包含1β086βbp的开放阅读框（ORF）,编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599βkDa。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

紫参薯查尔酮合成酶及异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮合成酶及其异构酶是黄酮类化合物合成途径中的2个关键酶,为研究其在紫参薯花青素合成途径中的功能,利用RT-PCR技术从紫参薯Da56块茎中克隆到查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,分别命名为DaCHS和DaCHI。结果表明:DaCHS基因包含825 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码274个氨基酸;DaCHI基因包含663 bp的完整开放阅读框,预测编码221个氨基酸。生物信息学分析结果表明,紫参薯DaCHS与油棕Eg CHS亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%;紫参薯DaCHI与野茶树CaCHI亲缘关系最近,氨基酸相似性达到67%。实时荧光定量PCR检测结果表明,DaCHS和DaCHI基因均具有组织表达特异性,其中DaCHS在花中相对表达量最高,而DaCHI在块茎中相对表达量最高;在紫参薯块茎发育不同时期的表达分析表明,DaCHS、DaCHI均在薯块膨大期相对表达量最高。本研究通过对DaCHS和DaCHI基因全长cDNA序列的克隆与分析,为紫参薯花青素合成途径的遗传调控及花青素形成机理的研究奠定基础。     

花生查尔酮异构酶基因的克隆及其序列分析

利用RT-PCR及RACE技术从花生种子中克隆得到查尔酮异构酶基因(chi)的cDNA全长序列,命名为Ahchi,NCBI登录号:JN412735,该序列全长共1 061 bp,编码209个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物具有很高的同源性,与大豆、倒捻子、蓖麻、毛果杨的同源性分别为81%、71%、70%和69%,且含有高度保守的活性位点。     

茶树ACC合成酶基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

乙烯是一种重要的植物激素,参与植物许多生理过程。ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成酶(ACS)是植物乙烯合成过程中的限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。利用其它植物ACS基因的保守序列设计兼并引物,采用RACE(Rapid Amplificationc DNA Ends)和RT-PCR等技术,克隆得到编码茶树ACS基因的全长cDNA序列,长1579bp,编码478个氨基酸,预测分子量约为53.7kD,等电点8.039,GenBank登录为EF205149。以Neighbor-Joining法构建进化树,发现茶树ACS基因与柿树中的同类基因亲缘关系最近。茶树ACS基因的克隆为从分子水平认识乙烯在茶树上的生理作用奠定了基础。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

儿茶素在食用植物油中的抗氧化应用效果

采用一种食用有机溶剂溶解儿茶素,而后添加到新鲜的植物油中,比较儿茶素与几种常用的合成抗氧化剂在植物油中的抗氧化效果,并用ＮＤ－１００１ＤＰ测色色差计测定儿茶素的氧化产物对油脂色泽及清亮度的影响。结果显示,儿茶素的抗氧化效力强于ＢＨＴ、ＴＢＨＱ和维生素Ｅ等合成抗氧化剂。不过,儿茶素氧化后对油脂的色泽及清亮度有一定影响,但可通过添加某些有机酸（如柠檬酸等）增效剂加以改善。文中还对儿茶素在植物油中的抗氧化机理和中介物质进行了讨论。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。