人工感染绵羊肺炎支原体后绵羊甘露聚糖结合凝集素变化及组织病理学

为探讨绵羊甘露聚糖结合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)对绵羊肺炎支原体抗性的研究,选取17只2月龄健康的中国美利奴羊,14只为试验组,3只为对照组。相同饲养条件下人工感染绵羊肺炎支原体,于攻毒前1周、攻毒后3周观察临床症状,并通过ELISA检测羔羊血清MBL水平,结果显示,试验组攻毒后不同个体MBL含量水平整体下降。宰杀后进行组织病理学评分,重度、中度、轻度病理变化的评分分别为18分以上、12分左右、9分左右,该评分结果与临床观察结果一致,可知攻毒前血清MBL水平越高评分越低。表明MBL对绵羊肺炎支原体有抗性。     

不同MBL基因型绵羊感染绵羊肺炎支原体后的免疫相关因子表达规律分析

将32只2月龄中国美利奴羊人工感染绵羊肺炎支原体(MP),分别在攻毒前1 d(-1 d)、攻毒后1 d、7 d、14 d和21 d收集新鲜抗凝血,提取总RNA后应用Real-time PCR的方法定量检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α,补体C1、C3和甘露糖结合凝集素(MBL)。结果表明,不同MBL基因型绵羊攻毒感染后血清MBL浓度呈下降趋势,其中MBL浓度较高的C型和D型绵羊,其促炎因子IL-2、IFN-γ浓度较高,抗炎因子IL-4在攻毒后1d呈升高趋势,此后开始下降;MBL浓度较低的A型和B型绵羊,攻毒后其TNF-α浓度升高显著,随炎症的舒缓,逐渐降低;补体C1和C3在攻毒后表现出不同的变化,证实MP感染后,激活补体途径,可能与MBL的浓度变化有关。     

中国美利奴羊不同MBL型个体感染绵羊肺炎支原体的免疫应答分析

为探讨中国美利奴羊不同甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)型个体感染绵羊肺炎支原体的免疫应答变化,对4种不同MBL型个体进行MBL水平测定,选择其中20只作为对照组,50只为试验组,在相同饲养条件下试验组人工感染绵羊肺炎支原体,分别在攻毒前1 d(-1 d)、攻毒后1 d(1 d)、1周(7 d)、2周(14 d)、3周(21 d)用ELISA方法定量分析血清中TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平.结果显示,A型和B型其MBL浓度较低,C型MBL浓度较高,与对照组相比,在攻毒后1周,A型和B型IFN-γ表达显著降低(P＜o.05),攻毒后2周,补体C3表达显著降低,TNF-α升高显著(P＜0.05);与A型和B型相比,在攻毒后1周,C型IFN-γ表达增加(P＜0.05),在攻毒后2周,补体C3表达增加、TNF-α显著降低(P＜o.05),补体C1各组均不显著.结论:低血清MBL浓度与绵羊支原体肺炎有一定的相关性,不同基因型之间其TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平有差异,低浓度MBL绵羊更易发生比较严重的炎症反应.     

绵羊支原体肺炎中不同甘露(聚)糖结合凝集素基因型对肺组织病变的影响

为建立不同甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)基因型绵羊支原体肺炎的动物疾病模型,本研究选择MBL外显子1中4种不同基因型共32只绵羊作为试验组,6只健康羊作为对照组,在人工感染绵羊肺炎支原体3周后全部迫杀,取肺脏组织做病理切片,以组织病理学评分确定肺部的炎症反应程度.不同MBL型绵羊的肺脏呈现不同程度病理改变,组织病理学评分结果为MBLA型和B型平均分为18.3和19.1,表现为重度病变;MBLD型平均分为12.3,为中度病变;MBL C型平均分为8.9,为轻度病变.本研究以组织病理学评分方法客观量化了不同MBL基因型肺部炎症反应的严重程度,根据评分结果推测MBL A型和B型为易感型,C型为抗性型.本研究利用组织病理学评分方法对其肺炎程度进行量化评价,为筛选绵羊支原体肺炎抗性基因型提供依据.     

注射甘露糖结合凝集素治疗人工感染绵羊肺炎支原体的效果

研究探讨甘露糖结合凝集素(MBL)治疗人工感染绵羊肺炎支原体的效果,揭示MBL蛋白对绵羊支原体肺炎的免疫调节作用,为阐明绵羊肺炎支原体的致病机制提供依据。人工感染绵羊肺炎支原体2周后注射MBL蛋白,对绵羊进行剖检,以及荧光定量PCR检测血浆MBL蛋白和重组MBL蛋白治疗前后,MBL、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、C1、C3的表达变化。结果显示,注射重组MBL蛋白3周后可以减缓患病羊的病程,肺部出血斑和出血点都有轻微的减轻,与无注射治疗的对照组比较,临床症状和病理变化较轻。蛋白治疗7d后血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、C3的表达水平升高,14d后呈现下降趋势,但高于对照组。MBL蛋白治疗后,患病绵羊血清中MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表达量均升高,随后减少,证明MBL蛋白能短期内减轻绵羊支原体肺炎症状以及增强机体的细胞和体液免疫,提高机体的抵抗力并改善炎症。     

感染绵羊肺炎支原体前后绵羊血清中相关细胞因子的动态检测

为研究绵羊感染绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)前后体内细胞因子含量的变化,将6只盘羊杂交羊和6只巴什拜羊人工感染MO,在感染前后采集静脉血,分离血清,用ELISA方法检测IL-5、IL-9、IL-12及IL-13含量。结果显示:2组羊在感染后IL-5浓度均升高,第7(P0.05)、14(P0.01)和21天(P0.01)盘羊杂交羊IL-5含量显著和极显著高于巴什拜羊;感染后第7(P0.01)、14(P0.01)和21天(P0.05)盘羊杂交羊的IL-9浓度极显著和显著地高于巴什拜羊;在感染后的第7(P0.05)、14(P0.01)和第21天(P0.01),盘羊杂交羊的IL-12浓度显著和极显著地高于巴什拜羊;在感染后的第5(P0.05)、7(P0.05)、14(P0.01)和21天(P0.01),IL-13浓度巴什拜羊显著和极显著低于盘羊杂交羊。结果表明:绵羊感染MO前后血清中IL-5、IL-9、IL-12及IL-13的浓度有明显变化,巴什拜羊和盘羊杂交羊的上述细胞因子变化也有显著差异,这对研究支原体肺炎发病机理及临床诊断有指导意义。     

人工感染绵羊肺炎支原体后绵羊血清中细胞因子的动态变化

为探讨人工感染绵羊肺炎支原体后绵羊相关细胞因子的变化,将18只试验羊分为A、B、C三组,A组为盘羊杂交羊,B、C组为巴什拜羊,其中A、B组气管内感染绵羊肺炎支原体2 mL/只(106CCU/mL),C组为对照,气管内注射生理盐水2 mL只。应用ELISA方法检测绵羊血清中IL-2、IL-4和IL-6的浓度。结果表明,IL-2的浓度在感染后第1天,A、B两组显著高于C组(P<0.05);在第7¹4天,B组显著高于A组和C组(P<0.05);在第14天,A组显著高于C组(P<0.05);在第21天,B组极显著高于A组和C组(P<0.01)。IL-4的浓度分别在感染后第1、7与14天,A组极显著高于B组和C组(P<0.01),其中C组显著高于B组(P<0.05)。IL-6的浓度在感染后第1天,A组和B组显著高于C组(P<0.05);在感染后第7天,A组显著高于B组和C组(P<0.05),其中B组显著高于C组(P<0.05);第1414天,B组显著高于A组和C组(P<0.05);在第14天,A组显著高于C组(P<0.05);在第21天,B组极显著高于A组和C组(P<0.01)。IL-4的浓度分别在感染后第1、7与14天,A组极显著高于B组和C组(P<0.01),其中C组显著高于B组(P<0.05)。IL-6的浓度在感染后第1天,A组和B组显著高于C组(P<0.05);在感染后第7天,A组显著高于B组和C组(P<0.05),其中B组显著高于C组(P<0.05);第14²1天,A组极显著高于B组和C组(P<0.01)。说明不同品种的羊对肺炎支原体感染引起的细胞因子的变化有差异,这对研究支原体肺炎发病机理及提供免疫治疗有指导意义。     

绵羊肺炎支原体感染羊细胞因子的动态变化

为检测绵羊在感染绵羊肺炎支原体(MO)前后细胞因子的含量变化情况,将6只巴什拜羊和6只盘羊杂交羊人工感染MO,在感染前后分别采集静脉血,分离血清,用ELISA方法检测IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10及IFN-γ含量。结果显示:两组羊在感染后IL-1β浓度均升高,第21天巴什拜羊的IL-1β含量降低,且显著低于杂交羊(P0.05);感染后两组的TNF-α含量逐渐升高,第14~21天巴什拜羊TNF-α含量开始下降,且第14天显著低于杂交羊(P0.05),第21天极显著低于杂交羊(P0.01);感染后第14和21天,巴什拜羊的IL-8含量开始下降,而杂交羊则继续升高,且杂交羊IL-8含量均极显著高于巴什拜羊(P0.01);两组羊的IL-10含量在第5天达到最高,且杂交羊极显著高于巴什拜羊(P0.01),而第14和21天巴什拜羊显著(P0.05)和极显著(P0.01)高于杂交羊;感染后两组羊的IFN-γ含量逐渐升高,第14~21天,巴什拜羊的IFN-γ含量开始下降,而杂交羊则继续升高,第14和21天巴什拜羊显著(P0.05)和极显著(P0.01)低于杂交羊。结果提示:绵羊感染MO前后细胞因子变化明显,巴什拜羊和杂交羊细胞因子变化也有差异,这对研究支原体肺炎发病机理及免疫治疗有指导意义。     

绵羊肺炎支原体黏附因子的定点突变及原核表达

本研究采用点突变PCR方法成功克隆并表达了绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoiae,M.O)内蒙古分离株(SZWQ株)的黏附因子基因(SZWQ-860)。表达产物经SDS-PAGE电泳检测,与预期目的蛋白的大小一致,将重组蛋白纯化后经Western blot检测,结果表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

巴什拜羊与其杂交羊对绵羊肺炎支原体感染的比较

为了比较巴什拜羊与其杂交羊对绵羊肺炎支原体(MO)感染的差异,将6只巴什拜羊和6只杂交羊人工感染MO,分别观察其临床症状和病理解剖变化,用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度,制作肺部组织切片观察组织病理学变化,并进行组织病理学评分。结果显示,感染后杂交羊比巴什拜羊表现出更严重的、典型的支原体肺炎的临床症状和病理剖检变化。组织病理学评分结果显示,杂交羊的评分显著高于巴什拜羊。相关细胞因子检测结果显示,杂交羊血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度均显著高于巴什拜羊。结果表明,巴氏拜羊对MO感染具有一定的抗性,而杂交羊对MO较易感。     

巴什拜羊、盘羊杂交羊重组SP-A蛋白对体外培养MO增殖的影响

为研究巴什拜羊和盘羊杂交羊的重组肺表面活性物质相关蛋白A(rSP-A)对体外培养的绵羊肺炎支原体(MO)增殖的影响,本研究利用不同浓度(10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL)巴什拜羊和盘羊杂交羊的rSP-A添加于MO培养液中进行体外培养,采用平板菌落计数和荧光定量PCR方法检测其对MO增殖的影响。平板菌落计数结果显示,巴什拜羊的3个rSP-A浓度组菌落数分别比对照组减少了8.35%(p>0.05)、23.04%(p<0.05)和40.03%(p<0.01);盘羊杂交羊的3个rSP-A浓度组菌落数分别比对照组减少了6.73%(p>0.05)、21.74%(p<0.05)和37.11%(p<0.01)。荧光定量PCR检测结果显示,添加rSP-A培养4h后MO16SrRNA基因拷贝数降至最低,巴什拜羊3个rSP-A浓度组16SrRNA基因拷贝数比对照组下降了72.15%(p<0.05)、78.81%(p<0.01)、81.48%(p<0.01);盘羊杂交羊的3个rSP-A浓度组的MO16SrRNA基因拷贝数比对照组下降了26.26%(p>0.05)、76.62%(p<0.01)、80.83%(p<0.01)。研究表明,巴什拜羊和盘羊杂交羊的rSP-A对体外培养的MO具有明显的抑制作用。本研究比较了不同品种羊SP-A蛋白在抗MO感染中的作用,为进一步研究盘羊杂交羊易感MO的分子作用机制奠定基础。     

绵羊肺炎支原体Y98株未知基因Hsp70（DnaK）的克隆

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）是绵羊传染性胸膜肺炎（Contagious ovine pleuropneumo-nia）的主要致病菌。热休克蛋白Hsp70也叫（DnaK）,具有分子伴侣和免疫的作用。本试验以MO Y98基因组为模板,通过比对15种支原体Hsp70基因的序列并设计简并引物,分别利用同源克隆和染色体步移—Tail-PCR技术克隆到了四段Hsp70（DnaK）基因片断并进行了核苷酸序列测定。利用序列拼接软件对克隆的四段序列进行序列拼接,通过ORF Finder软件分析出了MO Y98的Hsp70的开放式阅读框架,预测分析该基因是由1 815bp组成,编码604个氨基酸。本试验于国内外首次克隆到了MO的Hsp70基因序列,为MO的抗原研究以及Hsp70的功能研究等奠定了基础。     

宁夏不同绵羊品种中绵羊肺炎支原体的调查

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)在不同品种绵羊中的感染情况,项目采集宁夏盐池、平罗两地的4个绵羊品种(滩羊、陶寒杂、杜寒杂和滩寒杂)的鼻拭子标本403份,提取DNA并用绵羊肺炎支原体特异性PCR进行检测,统计不同品种、年龄段绵羊体内绵羊肺炎支原体的检出情况。结果表明,滩羊、陶寒杂、杜寒杂和滩寒杂的绵羊肺炎支原体的检出率依次为52.0%、83.0%、75.5%和85.7%;滩羊在3月龄以下及8月龄以上的检出率最低,分别为24.2%和34.4%,3月龄至8月龄的检出率为94.3%;陶寒杂、滩寒杂在各年龄段的检出率均在74.0%以上;杜寒杂3月龄以下的检出率为56.3%,3月龄以上的检出率在82.0%以上。结果表明,宁夏地区规模化饲养的绵羊中,绵羊肺炎支原体广泛存在,较滩羊而言,其他杂交品种羊更易感染绵羊肺炎支原体。     

互助藏羊肺炎病原绵羊肺炎支原体的PCR检测与分析

青海省互助某羊场藏系绵羊发生肺炎疾病,为了快速准确诊断藏羊肺炎发病的致病病原微生物,及时防控和治疗,采集病死绵羊肺样品,利用PCR分子生物学方法进行鉴定与生物信息学分析。经过分子鉴定,此羊场引发肺病的病原是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO);测序结果显示样品中鉴定的为同一株病原,鉴定的菌株的16S rRNA基因与参考序列EU265779的同源性达到99.86%。同时遗传进化树显示,鉴定的菌株与GenBank中的绵羊肺炎支原体聚成一大支,其关系最近,在进化角度证实此次鉴定的确实为绵羊肺炎支原体。结果表明,此羊场引发肺炎疾病的病原是绵羊肺炎支原体,提示要对羊群进行相关的病原学研究和流行病学调查,为针对性地对细菌性病原进行对症治疗提供参考。     

中国美利奴(新疆军垦型)羊遗传多样性的微卫星分析

利用6个微卫星标记,采用PCR扩增,对200只中国美利奴(新疆军垦型)羊基因组DNA的遗传多样性进行了检测。统计了各位点的多态信息含量(PIC)、遗传杂合度(H)、有效等位基因数(E)和基因纯合率(Rh)等遗传指标。结果表明:除BMS772(PIC=0.2571)为中度多态外,其余微卫星位点均为高度多态;群体的平均PIC、H、E、Rh分别为0.5446、0.5684、2.5695和0.6165,此品种绵羊基因多态性和遗传多样性相对贫乏,而基因纯合率相对较高;只有BM6506位点处于哈代-温伯格平衡(P>0.05)。     

甘肃地区绵羊支原体病原菌的分离培养

在甘肃省5个地区采集了100份绵羊血清样本,并对100份样品进行了血清学及病原菌分离培养试验。血清学检测初步鉴定为14份阳性,其中11份来自于同一地区。然后对两例疑似患病羊做病原分离鉴定以及微生物学诊断和PCR鉴定,并对病原菌进行革兰氏染色。本研究成功地从病羊身体中分离出细小、纤细的呈球形、双球形、线状、螺旋状、半月状和短杆状等形态的绵羊肺炎支原体。