猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物.通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达我体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达.重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符.Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1:100,阳性标准为:待检血清D150≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D4502,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性.随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础.     

甲型流感病毒抗原表位融合多肽的原核表达及免疫原性分析

根据甲型流感病毒多个株系的血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)、基质蛋白(matrix,M1)和核蛋白(nucleoprotein,NP)的核苷酸序列的保守序列,筛选、设计并合成串联的DNA片段hmn,体外扩增hmn DNA,将之亚克隆至原核表达载体pET28α(+)中,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),0.3mmol/L的IPTG诱导后,HMN以包涵体形式表达。重组蛋白HMN复性后经镍柱亲和层析纯化,纯化后的蛋白可与特异性抗血清发生反应,纯化蛋白皮下注射免疫6⁸周龄雌性小鼠,Western-blot检测抗体效价,显微观察小鼠脾脏和胸腺组织结构,流式细胞仪测定T淋巴细胞亚类数量,结果显示与对照组相比,HMN蛋白可明显刺激淋巴细胞增殖。本试验是对通用型流感多疫苗进行的有意义探索。     

流感病毒抗原表位的研究进展

流感病毒抗原表位的研究,不仅是对流感病毒致病机理和机体免疫系统反应的探究,还能很好地指导对流感的防治。作者从抗原表位的特点,流感病毒抗原表位的特点、研究进展及流感病毒抗原表位疫苗的应用几个方面进行了综述。     

犬吉氏巴贝斯虫截短型抗原BgTRAP的重组表达及其在诊断上的初步应用

吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白是一个重要的诊断抗原候选分子。为建立一种实用的犬吉氏巴贝斯虫血清学诊断方法,本研究选取Bg TRAP C-末端跨膜区前,包含TSP功能区和抗原区的411个氨基酸的编码基因片段,重组表达了一个可溶性截短型Bg TRAP抗原,解决了完整蛋白重组表达纯化的困难。免疫荧光试验表明,截短型抗原具有良好的抗原性。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验诊断抗原,可清晰地区分阴性及阳性犬血清,并与其他病原感染无交叉反应,具有良好的特异性。犬感染吉氏巴贝斯虫系列血清检测表明,该抗原可检测早期感染(4 d)和感染200 d以后的样本。结果提示,重组Bg TRAP截短型抗原可作为一种诊断制剂检测犬吉氏巴贝斯虫抗体。     

犬吉氏巴贝斯虫病的诊治

吉氏巴贝斯虫(Babesia gibsoni)病是寄生于犬的红细胞内所引起的血源性原虫病.传播本病的硬蜱主要有血红扇头蜱、镰形扇头蜱和长角血蜱,本病具有明显的季节性,多发生在5--9月份蜱盛行的季节.     

间接荧光抗体试验诊断犬吉氏巴贝斯虫病

利用冷藏抗原玻片 ,用间接荧光抗体试验检测感染吉氏巴贝斯虫犬血清 ,具有特异性强、敏感性高、快速、准确、操作简单等特点。对疫区 82份犬血清的检查 ,阳性率为 37 8% ;对非疫区 50份犬血清的检查 ,假阳性率为 2 %。与血液涂片染色检查比较 ,该法检出率高 ,结果可靠 ,可用于犬吉氏巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查     

犬吉氏巴贝斯虫病的诊治

<正>犬吉氏巴贝斯虫病是以蜱为传播媒介,虫体单个或成对地寄生于病犬红细胞内的一种血源性原虫病。临床上主要引起病犬严重贫血和血红蛋白尿。该病病程短、死亡率高,是严重危害我国宠物犬健康的主要疾病之一。本病具有明显的地方性和季节性,春、夏、秋季只要有蜱滋生的地方均可能感染该病。目前,大多数家养宠物犬常常在草地上玩耍,极易感染该病,并且在个别病犬皮肤上发现外寄生虫蜱。但是由于大多数畜主和宠物医生对该病认识不足,仅采用     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

克隆表达的犬吉氏巴贝斯虫重组GST-P130kDa 用于血清学诊断

利用抗体法（picoBlueTMImmunscreening Kit,应用B.gibsoni感染血清）从犬吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）裂殖子mRNA制备的吉氏巴贝斯虫cDNA文库中进行免疫筛选,选出目的基因相cDNA片段（阳性克隆）.测序验证后将该cDNA（基因）克隆至原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒,在大肠杆菌E.coli（DH5a）中以GST融合蛋白的形式表达（SDS-PAGE分析证明）;表达产物为130kDa的可溶性融合蛋白.免疫学分析（Western blot和ELISA）结果表明,犬吉氏巴贝斯虫重组GST-P130kDa融合蛋白（rBg GST-P130kDa）能与犬吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）感染血清起反应,且与犬巴贝斯虫（B.canis）无交叉反应.本试验利用犬吉氏巴贝斯虫重组BgGST-P130kDa融合蛋白（作为重组抗原）检测巴西（n=310）、日本（n=100）和中国（n=114,n=30）等国随机采集的自然感染狗血清,其结果为巴西狗血清阳性率为55%、日本为8%、中国为1～9%;其结果与间接荧光抗体法（IFAT）结果为一致（作为验证）.结果表明重组BgGST-P130kDa融合蛋白具有较强的免疫原性和特异性,可用于吉氏巴贝斯虫病的诊断,这为吉氏巴贝斯虫病的早期诊断和深入研究犬吉氏巴贝斯虫病的特异性重组抗原及重组疫苗奠定基础.     

犬吉氏巴贝斯虫病的诊治

<正>犬巴贝斯虫病是以蜱虫为传播媒介,引起溶血性疾病的一种血液原虫病,呈世界性分布[1]。该病的主要临床特征是患犬发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿[2]。寄生于犬的巴贝斯虫主要是犬巴贝斯虫和吉氏巴贝斯虫,我国主要以吉氏巴贝斯虫为主,呈地方流行性,对犬特别是警犬危害严重[3]。巴贝斯虫病属于人兽共患病,其主要的致病机理是破坏宿主红细胞,导致贫血、黄疸及红细胞的携氧功能受损,从而引起机体器官衰竭甚至死亡[4]。     

Epidemiological survey of Babesia gibsoni infection in dogs in Japan by enzyme-linked immunosorbent assay using B. gibsoni thrombospondin-related adhesive protein antigen

A nationwide epidemiological survey of Babesia gibsoni infection in non-fighting dogs was conducted using an improved ELISA with recombinant B. gibsoni thrombospondin-related adhesive protein (BgTRAP). A total of 1206 dogs from 27 prefectures were examined and 128 (10.6%) tested positive. In the eastern part of Japan, 39 dogs out of the 559 (7.0%) examined were positive, while 89 dogs out of 647 (13.8%) tested positive in the western part of Japan. Although the percentage of dogs that tested positive was significantly (p=0.0001) lower in the eastern part compared to the western part of Japan, overall these results indicate that B. gibsoni infection of dogs has a widespread geographic distribution throughout the country. A history of tick infestation was identified as a significant risk factor for B. gibsoni infection (p=0.0091), while sex (p=0.9411), age (p=0.0920) and breed (p=0.0549) of dogs were not statistically significant risk factors. These results indicate that tick infestation is the most dominant risk factor for B. gibsoni infection of non-fighting dogs in Japan and suggest that other B. gibsoni transmission routes, such as fighting and transplacental transmission, may be less important.     

含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24～48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

Analysis of risk factors associated with recurrence of canine babesiosis caused by Babesia gibsoni

Canine babesiosis due to Babesia gibsoni (B. gibsoni) displays severe clinical manifestations. Recurrence of babesiosis after anti-babesial treatment is observable in over 10 % of the patients. The present study ascertains the risk factors and cumulative incidence of recurrence of canine babesiosis. For a sample of 145 dogs diagnosed with acute babesiosis, the following parameters were assessed over a period of 16 weeks: haematological parameters, status of anaemia, platelet count, total WBC count, haemoglobin concentration and RBC count, concurrent haemoparasitism, and secondary immune mediated haemolytic anaemia (IMHA). Patient demographics such as age, breed, sex were also recorded. The potential risk factors were statistically evaluated by the cumulative incidence function and the Kaplan-Meier method. The recurrent infections were observed in 11.8 % of the study sample. The following factors were found to associate with increased risk of recurrence: Rottweiler breed (CIR 21.8 % ± 6.9 %; p < 0.05), secondary IMHA (CIR 28.7 % ± 11.3 %; p < 0.05), RBC counts < 2 × 10⁶/μl on the day of diagnosis (CIR 16 % ± 4.6 %; p < 0.05), and persistent anaemia over 20 days post treatment (CIR 29.14 ± 7.9 %; p < 0.001). Dogs with concurrent haemoparasitic infections were predicted to have a fatal outcome in the survival analysis (disease related mortalities 25 % ± 13 %; p < 0.001). According to the findings, veterinarians need to pay attention to Rottweiler breed, dogs with secondary IMHA, concurrent haemoparasitism, low RBC counts on diagnosis and those with persistent anaemia to reduce the risk of relapse.     

犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合

为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平.利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成.利用peDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性.结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%.同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性.     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。     

Incidence of canine Babesia gibsoni infection and subclinical infection among Tosa dogs in Aomori Prefecture, Japan

To identify the incidence of Babesia gibsoni (B. gibsoni) in Aomori Prefecture, northeastern Japan, dogs with acute B. gibsoni infection were investigated at the Animal Teaching Hospital, Kitasato University, between April 2002 and March 2003. Eighteen dogs with acute B. gibsoni infection were recognized; they were all male dogs of the fighting dog breed Tosa. Their platelet counts were below normal and their packed cell volumes (PCVs) were at various levels. We collected blood samples from 141 Tosa dogs from Aomori Prefecture and used polymerase chain reaction assay to investigate the incidence of subclinical B. gibsoni infection. We also looked into the serological abnormalities associated with thrombocytopenia or anemia in subclinical infection. Forty-one of 87 dogs (47.1%) with histories of dog fighting, and one dog of 54 without a history of dog fighting were positive for B. gibsoni; that is, 42 of 141 dogs (29.8%) showed a positive result. The mean platelet counts of dogs with subclinical infection were significantly lower and levels of anti-platelet IgG were significantly higher than levels for dogs without infection. Anti-erythrocyte membrane IgG levels were significantly higher in dogs with subclinical infections, although mean PCVs were not significantly different. Tosa dogs from Aomori Prefecture, Japan, were highly infected with B. gibsoni subclinically and this pathogen might be successfully transmitted during dog fighting. Dogs with subclinical infections were at risk of chronic thrombocytopenia, which may be due to autoimmune mechanisms.     

禽腺病毒1型和4型六邻体蛋白抗原表位和密码子偏爱性分析

为了研究禽腺病毒1型和4型(AAV-1和AAV-4)六邻体抗原表位和同义密码子的使用情况,运用生物学软件Antheprot 5.0和EMBOSS的CHIPS、CUSP程序分别对AAV-1和AAV-4六邻体进行了分析,并将分析结果与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较.结果显示,AAV-1、AAV-4六邻体的抗原表位区都主要集中在前段、中段,推测具有型和群特异性表位,可作为诊断型和群的首选蛋白.AAV-1和AAV-4六邻体的Enc值分别为43.553和38.475,在编码密码子使用频率上都存在明显差异,与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性也不同,其表达系统选择大肠埃希菌较为合适.     

吉氏巴贝斯虫mRNA的磁性分离及cDNA合成

从感染吉氏巴贝斯虫的摘脾犬的红细胞内提纯虫体,用异硫氰酸胍法提取虫体总RNA,再以Poly(A)~ mRNA磁性分离系统提取mRNA.最后以NotⅠPrimer-Adaptor为引物反转录出cDNA片段.琼脂糖凝胶电泳显示,所合成的cDNA分子量范围由100到6500bP,且绝大部分大于500bP.     

PEDV S基因的B细胞表位嵌入型乳杆菌S-层蛋白的原核表达及其鉴定

利用生物软件和在线数据库中筛选出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S基因的B细胞表位,通过overlap PCR方法将其嵌入到嗜酸性乳杆菌的S-层蛋白基因中,获得融合基因SLP-EpitopeS。将该融合基因导入到原核表达载体pGEX-4T-3中,成功构建了原核表达载体pGEX-SLP-EpitopeS。经过双酶切和PCR方法以及基因测序方法验证融合表达载体pGEX-SLP-EpitopeS的正确性。应用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物,其中SDS-PAGE结果显示:融合蛋白质的大小约为77 000,与理论值相符;Western blot结果显示:融合蛋白SLP-EpitopeS被GST血清所识别,而B细胞表位分别被表位特异的鼠源单克隆抗体(McAb)和表位合成多肽所识别。本试验为进一步嵌入型蛋白SLP-EpitopeS的免疫原性研究奠定了基础。