小麦蓝矮病植原体的寄主范围研究

小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播。利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4kb的特异片段。通过介体条沙叶蝉对小麦蓝矮病植原体寄主范围进行研究,在接种的18种寄主植物中,有8种寄主表现症状,表明小麦蓝矮病植原体寄主范围广泛。     

小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

采用nested-PCR技术对小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段进行扩增,并对扩增片段进行了序列测定及分析。结果表明,nested-PCR扩增得到约1.2kb的特异片段,经核苷酸序列测定获得小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因序列(1136bp);小麦蓝矮病植原体(WBD)与16Sr组中的各亚组代表植原体亲缘关系均达到96%以上,其中与三叶草变叶病植原体(CPh株系)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.7%,归为翠菊植原体(CandidatusPhytoplasmaasteris)16Sr-C亚组,该结果与以前报道的利用16SrDNA的分组结果一致,从亚组水平上进一步确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位。     

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu) tuf基因序列的同源性分析

 【目的】利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因，从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶；用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增；核苷酸序列测定及分析。【结果】经电镜超微结构观察，在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850 bp的特异片段。感受态转化后，进行测序，结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842 bp，编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性，结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变（KVF）亲缘关系最近，核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％。【结论】从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位，为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。     

小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白rpl22和rps3的生物信息学分析

【目的】将生物信息学方法应用于小麦蓝矮病植原体(WBD)的分类研究,确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】应用植原体核糖体蛋白(rp)基因通用引物对rpF1/rpR1,对WBD进行PCR扩增并得到特异片段,对特异片段进行测定及同源性分析。【结果】序列测定结果表明,WBDrp基因片段长1 240 bp,包含部分rps19基因和全部的rpl22和rps3基因,且后2个基因为重叠基因,分别编码129和252个氨基酸,rpl22和rps3蛋白的等电点分别为12.605和11.755。【结论】WBD与16SrⅠ-C亚组中三叶草绿变病(Clover phyllody)的KVE、KVG、CPh株系亲缘关系最近,核苷酸同源性依次为99.7%,99.6%和99.0%,WBD与KVE株系的rpl22和rps3基因编码的氨基酸同源性分别为100%和98%,因此将小麦蓝矮病植原体划归到16SrⅠ-C亚组。     

不同抗性小麦品种感染蓝矮病植原体后体内防御酶活性的研究

【目的】通过研究小麦体内过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解胺酶活性的变化规律与植原体侵染过程及品种抗病性的关系,从生理生化学角度揭示小麦品种抗蓝矮病的机制,为蓝矮病的防治和生产上选育优质小麦抗病品种提供理论依据。【方法】对抗、感小麦品种(烟D27、小偃6号)接种小麦蓝矮病植原体,观察其症状变化,同时采用紫外分光光度计法,定期测定小麦叶片的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及苯丙氨酸解胺酶(PAL)活性并进行比较分析。【结果】症状观察发现,感病品种的潜育期为12 d左右,抗病品种为18 d左右。防御酶活性的测定表明,随着植原体的侵染,抗病品种的3种防御酶活性均有不同程度的提高,活性提高幅度较大的时期因酶而异,但早于感病品种;感病品种防御酶活性升高较慢且较抗病品种滞后,有时甚至出现酶活性下降现象。【结论】小麦蓝矮病潜育期长短因品种抗性而异,3种防御酶活性变化规律不仅与品种抗性有一定的相关性,而且与植株发病程度密切相关,这些防御酶活性出现的峰值高低与早晚,可作为小麦抗蓝矮病早期鉴定的一种有价值的重要生理指标。     

小麦蓝矮病植原体FrvX基因的克隆及致病性测定

【目的】克隆小麦蓝矮病(WBD)植原体β-1,4-内切葡聚糖酶基因(FrvX),验证其在植原体侵染寄主中的作用,为更好地防控小麦蓝矮病奠定理论基础。【方法】采用PCR技术从小麦WBD植原体中扩增到FrvX全基因,将其插入到病毒载体pgR107中,构建重组病毒载体pgR107-FrvX,用农杆菌介导法侵染本氏烟草,观察烟草表型的变化。【结果】FrvX基因全长1071bp,编码356个氨基酸。重组病毒载体接种烟草22d后,有9株烟草植株表现出明显的花叶、黄化症状,RT-PCR检测到发病植株接种7d后的叶片有FrvX基因的转录。【结论】FrvX基因接种烟草导致烟草表型发生变化,推测其与植原体病害的发生有关。     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子互作蛋白的筛选与分析

【目的】揭示小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)的致病机理及其与寄主的互作关系,为植原体病害防治提供理论依据。【方法】以SWP16为诱饵,将SWP16构建到诱饵载体pBT3-STE和pBT3-SUC上,在小麦酵母双杂交膜系统cDNA文库中筛选与SWP16互作的蛋白,并确定最佳的筛库条件。通过α-半乳糖苷酶活性检测试验对筛选到的互作蛋白进行二次验证,并运用Uniprot对其进行Gene Ontology（GO）注释分析。【结果】以pBT3STE-SWP16作为筛库的诱饵蛋白,确定20 mmol/L 3-AT为筛选文库的最佳浓度,从小麦cDNA文库中筛选到20种互作蛋白,包括Rieske 蛋白、细胞色素b5、CASP蛋白等。经过复筛和α-半乳糖苷酶活性检测试验进一步验证了互作关系,其中14种互作蛋白参与运输、pH调节、光合作用、内质网应激反应、蛋白质泛素化等生理过程;18种互作蛋白存在于线粒体、内质网、细胞膜、细胞质、叶绿体和细胞壁等6种细胞组分中;20种互作蛋白的分子功能主要包括几丁质酶活性、反转运蛋白活性、脱水酶活性、转移酶活性和转录因子活性等。【结论】筛选获得20种与小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP16互作的蛋白,有助于推动小麦蓝矮植原体与寄主互作关系的研究。     

应用分子生物学方法检测植原体研究进展

 从血清学、核酸杂交技术以及PCR技术等方面综述了国内外植原体检测研究的概况及最新进展。     

小麦类菌原体兰矮病寄主范围和品种抗病性初步研究

对小麦类菌原体兰矮病寄主范围和品种抗病进行了测试，发现新寄主玉米，甜玉米裸麦，筱麦，簇毛麦，节节麦，野燕麦，金色狍尾草，稗，无芒稗，牛筋草和狼尾草，小麦品种对该病的抗病性存显著差异。     

我国冬麦区小麦品种抗蚜性鉴定

采用蚜量比值法对目前我国推广种植的84个高产、优质小麦品种和有苗头的优质小麦新品系,进行了初步的抗蚜性鉴定,结果表明,供试品种(系)的抗蚜能力普遍较低,绝大部分小麦品种表现为感蚜虫。比较各供试小麦品种(系)上麦蚜的蚜量比值可知,对荻草谷网蚜、禾谷缢管蚜及混合种群表现感虫性的品种(系)分别占供试小麦品种(系)的86.90%,57.14%和86.90%。麦蚜的消长曲线也表明各供试小麦品种(系)不抗蚜虫。     

中国冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

 利用SDS-PAGE分析了国内外306份小麦品种（系）Waxy蛋白的缺失类型，筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料46份；通过对济麦19×豫麦47的120个F2单株Waxy蛋白亚基分析，发现缺失Wx-B1的比例接近1/4，符合孟德尔分离规律。利用3个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定，验证其在分子标记辅助育种中的有效性。结果表明，Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条1 172 bp的特异带，而缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带；Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带，缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段；Wx-7D位点的STS引物在野生型中扩增出1条940 bp的特异带，而在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中则扩增出1条360 bp的特异带；Wx-7D位点的SSR引物在野生型中扩增出1条204 bp的特异带，在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这4个标记可以用于分子标记辅助育种。     

Molecular Characterization of Atlas 66-Derived Wheat Near-lsogenic Lines Contrasting in Aluminum （Al） Tolerance

Aluminum （Al） toxicity is the major limiting factor for wheat growth in acidic soils. Genetic improvement of Al tolerance is one of the most cost-effective solutions to improve wheat productivity. The objective of this study was to characterize near isogenic lines （NILs） contrasting in Al tolerance derived from Atlas 66 in the backgrounds of Al-sensitive cultivars Chisholm and Century using amplified fragment length polymorphism （AFLP） and simple sequence repeat （SSR）. A total of 200 AFLP and 88 SSR primer pairs were screened and 12 markers （11 AFLPs and one SSR） were associated with Al-tolerance in NILs of at least one recurrent parental background. Among them, nine were linked to A1 tolerance in the Chisholm-derived NILs, seven were associated with Al-tolerance in the Century-derived NILs, and three AFLPs derived from the primer combinations of pAG/mGCAG, pCAG/mAGC and pGTG/mGCG, and one SSR, Xwmc331 on chromosome 4D, associated with A1 tolerance in NILs of both recurrent parental backgrounds. Those common markers across two backgrounds may be the major marker loci associated with Al-tolerance in Atlas 66 and could be useful for marker-assisted breeding to improve Al tolerance in wheat. In addition, evaluation of Al tolerance among different genotypes using hematoxylin stain and relative root growth revealed that Atlas 66 was more tolerant to Al stress than the NILs, therefore suggested that the Al-tolerant NILs might not carry all Al-tolerance loci from Arias 66 and inheritance of Al tolerance in Arias 66 is more likely multigenic.     

小麦叶片内几个抗冷相关基因cDNA片段的克隆

运用RT-PCR法,从小麦叶片中克隆出SOD、CAT、APX、GR、CBF、GI等几个抗冷相关基因的cDNA片段,序列比对结果显示,这些基因与GenBank上已登录的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,表明克隆出了上述几个小麦抗冷相关基因,其中的APX和GR为普通小麦中首次报道。     

小麦DHAR基因的克隆及生物信息学分析

以电子克隆和RT-PCR克隆获得了1个小麦脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析.结果表明,该基因cDNA序列长1 187 bp,编码263个氨基酸,蛋白质分子量为28 908.2 Da,PI为6.84;具有GST-N家族和GST-C-DHAR结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族;该蛋白序列无信号肽,是亲水性蛋白,定位于细胞质叶绿体中,二级结构中以无规则卷曲(40.30％)和α螺旋(37.64％)为主,并含有少量的片层结构(17.11％);该蛋白序列与大麦、二穗短柄草、玉米、水稻、拟南芥的同源蛋白序列相似性较高,其中与大麦胞质DHAR(BAJ97007.1)蛋白进化距离最近.     

分子标记辅助选育兼抗白粉病、条锈病、黄矮病小麦新种质

 选育和推广多抗、兼抗型小麦品种是今后小麦育种发展方向之一。本研究通过复合杂交、回交，将抗白粉病基因聚合体Pm4 +Pm13 +PmV、抗条锈病基因YrX（源自YW243）、抗黄矮病基因Bdv2向优异农艺亲本转育。利用抗病性鉴定和分子标记辅助选择，选育出聚合了3～5个抗病基因的兼抗白粉、条锈和黄矮病的冬性小麦新种质和春性小麦新种质，其中聚合Pm4 +Pm13 +PmV +YrX +Bdv2等5个抗病基因的冬性材料1株，聚合Pm4 +Pm13 +YrX +Bdv2d 的冬性、春性（BC2F3）材料分别为2株、3株，聚合Pm4 +PmV +YrX +Bdv2等4个抗病基因的冬性、春性（BC2F3）材料分别为6株和18株，聚合Pm13 +YrX +Bdv2、PmV +YrX +Bdv2等3个抗病基因的春性材料分别为7株和46株。本研究可为小麦多抗、兼抗育种提供遗传组成明确的丰富抗源和快捷的选择方法。     

核不育矮败小麦在小麦育种上的应用研究

综述了矮败小麦在选育育种材料、建立目标性状基因库等方面的应用。并对今后矮败小麦的应用提出了建议。