潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。     

家蚕肌钙蛋白CⅢ基因的原核表达及其抗体的制备

家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究.     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d-PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120r/min,0.5mmol/L IPTG诱导60min。经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

人工合成的GFM cry11B基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

摘要: 用限制性内切酶酶切的方法把人工合成的GFM cry11B基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，构建成重组表达质粒pGC。在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达了GST-GFMCry11B融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21%，其表达产物主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理，用Glutathione Sephrose 4B纯化出GST-Cry11B融合蛋白。Thrombin酶切后得到Cry11B蛋白，将其作为抗原免疫家兔获得了滴度（ELISA）为1∶8000的抗血清，并具有较强的特异性。     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs)作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230～439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E.coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 k...     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化

本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件.     

bar因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的分离和纯化

bar基因来源于P3301质粒载体,通过构建PB813测序载体对bar基因进行了测序,与GenBank中bar基因全编码区比较发现：在DNA上有两个碱基不同,但在蛋白质水平上完全相同。用PCR方法从P3301载体上克隆了552碱基的bar基因全长序列插入到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET30a( )中,构建了pET30a-bar融合表达载体并转人大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-bar融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),并通过金属鏊和层析一步纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了PAT纯品。     

中国野生葡萄芪合成酶基因融合表达、纯化及多克隆抗体制备

根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。     

棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化

用合成的基因特异性引物通过RT-PCR扩增，获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)组织蛋白酶B基因(HCB)，将基因克隆到pGEX-4T-1载体，在大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α内进行扩增，经过PCR筛选获得阳性克隆并提取质粒和测序验证后，再转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物为组织蛋白酶B-谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白，分子量在63kD左右。表达产物形成了包涵体，经过对包涵体变性和复性处理，得到了可溶性的融合蛋白，可被Glutathione Sepharose 4B柱亲和纯化，用凝血酶裂解融合蛋白后，经SDS-PAGE分离到37kD左右的棉铃虫组织蛋白酶B酶原。N-末端氨基酸测序鉴定表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B。     

Prokaryotic Expression of Mouse Sox2 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibody

Sox2, one of genes which express in embryonic stem (ES) cells, plays an important role in selfrenewal of ES cells, and is used to make induced pluripotent stem (iPS) cells. In this study, we subcloned mouse (Mus muscules) full-length Sox2 cDNA and inserted Sox2 into pET-41 a expression vector. Then the recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells to express Sox2 fusion protein. The expressed products were identified by Western blot using anti-GST antibody. The result indicated that the size of Sox2 fusion protein was in 61 kD. And the protein was recovered from the SDS-PAGE. And we used the sox2 fusion protein to prepare polyclonal antibody. The Dot blotting result showed that the anti-Sox2 antiserum had 1:12,800 titers. The antibody will be useful for studying the function of Sox2 and its role in ES cell self-renewal.     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。