激活HH信号通路抑制猪ADSCs向脂肪细胞的分化

为探讨HH信号通路在脂肪细胞分化过程中的作用机制,以猪脂肪间充质干细胞(ADSCs)为材料,应用油红O染色法检测ADSCs成脂分化过程中的形态变化;采用荧光定量PCR及Western Blot的方法检测HH通路Gli1及脂肪细胞分化转录因子的时序表达。通过嘌呤衍生物2,6,9-三元取代嘌呤(Purmorphamine,PM)激活猪ADSCs细胞中HH信号通路,探讨体外激活HH信号通路对猪ADSCs向脂肪细胞分化的作用及其机制。结果显示,在成脂诱导分化的过程中,经5μmol/mL的PM持续处理,细胞中Gli1的mRNA及蛋白表达量增加;猪ADSCs向脂肪细胞分化的数目减少、细胞内甘油三酯含量降低;脂肪细胞分化关键转录因子C/EBPα和PPARγ的表达受到抑制。以上结果表明,激活HH信号通路可通过下调PPARγ和C/EBPα的表达抑制猪ADSCs向脂肪细胞的分化。     

腺苷甲硫氨酸对成肌细胞成脂分化及脂肪沉积的影响

【目的】以小鼠成肌细胞（C2C12）为模型探讨蛋氨酸代谢产物腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）对肌肉来源的多能干细胞成脂分化及脂肪沉积的影响。【方法】分别用含有0、0.25、1.0和2.0 mmol•L-1 SAM的培养基处理细胞,在处理后的0、24、36和48 h分别对各处理组细胞进行油红O染色观察细胞形态并测定光密度（OD）值;在处理后第2天收集细胞总RNA与总蛋白,分别用RT-PCR和western blotting方法检测细胞成脂相关基因的mRNA与蛋白表达水平。【结果】经SAM处理后,细胞表现出脂肪细胞的形态特征;细胞内脂肪沉积水平上升,并且随SAM处理浓度的升高呈现出剂量依赖效应;细胞的脂肪特异性基因PPARγ、C/EBPα的mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;其它特异性基因aP2、FAS及SREBP-1的表达在经SAM处理后呈剂量依赖性升高（P＜0.05）,其中2.0 mmol•L-1 SAM处理组升高最为显著,三者mRNA表达水平分别上升了6.86（P＜0.01）、3.45（P＜0.05）和3.48（P＜0.01）倍。【结论】SAM可以促进C2C12细胞成脂分化及细胞内脂肪的沉积。     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

FST基因的过表达对猪成纤维细胞内基因及生物学通路的影响

应用Illumina HiSeq测序平台,对过表达FST基因的细胞和正常细胞进行转录组测序,并对筛选的差异表达基因进行基因功能注释及信号通路分析。结果表明：过表达FST后共有286个基因的转录发生了变化,其中176个上调,110个下调。这些差异基因共得到44个GO功能注释,其中单一生物过程、代谢过程、细胞过程;细胞器、细胞区域、细胞和黏合terms下聚集的差异基因数量最多,均>100个。共发现9条显著富集的Pathway,包括与细胞增殖相关的细胞周期、DNA复制、碱基切除修复、p53信号通路等,与卵母细胞发育相关的卵母细胞减数分裂和孕激素介导的卵母细胞成熟通路。说明在成纤维细胞中过表达FST后,最显著的特征是与细胞增殖分化相关的基因和生物学通路被富集。     

家蚕Notch信号通路基因的表达研究

[目的]研究家蚕Notch信号通路基因的表达情况。[方法]在实验室前期工作的基础上,用特异引物对家蚕的Notch信号通路上下游基因进行克隆,并对这些基因在家蚕5龄幼虫不同组织部位的表达进行研究。[结果]这些基因在各组织的表达量不同,其中fringe和groucho在家蚕头部表达量较多,在丝腺、精巢、卵巢中的表达量较少;notch在家蚕尾部表达量较少,在其他组织中表达量无明显差别。[结论]该研究为进一步研究家蚕Notch信号通路奠定了基础。     

葡萄糖浓度对实验小型猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响

为了探索不同浓度葡萄糖对实验用小型猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响,本文采用胶原酶消化法分离皮下前体脂肪细胞,采用高浓度葡萄糖(4500mg/L)和低浓度葡萄糖(1000mg/L)DMEM培养基对细胞进行培养和体外诱导成脂分化,结果表明,与低浓度组相比,高浓度葡萄糖可显著促进实验用小型猪前体脂肪细胞的增殖,体外诱导分化后...     

白桦BpSOC1基因的克隆及时序表达分析

根据NCBI中已注册的近缘树种的SOC1同源基因序列设计引物,采用RT-PCR技术在4年生白桦茎尖中分离得到1条SOC1-like cDNA序列,命名为BpSOC1。该序列编码区长660 bp,编码220个氨基酸,蛋白质相对分子质量为25 367.77 D,理论等电点为9.32。蛋白结构预测分析表明,BpSOC1具有典型的MADS-box结构域和K-box结构域,同时具有多处DNA结合位点、糖基化位点和磷酸化作用位点,属于MADS家族转录因子。系统发育分析表明,BpSOC1属于MADS-box家族的SOC1/TM3亚家族。采用实时定量PCR技术研究不同树龄白桦BpSOC1从5月初至9月在茎尖的时序表达规律,结果显示:BpSOC1无论在2年生苗期的营养生长阶段还是进入3、4年生的生殖生长阶段均有表达,表达高峰均在7月初和9月初。但2年生苗期的BpSOC1表达量最高的7月初和9月初间无显著差异,而进入生殖生长期后9月初的BpSOC1表达量显著高于7月初的表达量,表明Bp-SOC1既参与白桦的营养生长,又参与生殖生长。     

DHA对小鼠脂肪组织和肝脏生脂及脂解基因转录表达的影响

【目的】探讨二十二碳六烯酸(DHA)对小鼠脂肪组织和肝脏生脂相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白-1c基因(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶基因(FAS),及脂解相关基因激素敏感脂酶基因(HSL)和甘油三酯水解酶(TGH)时序表达的影响。【方法】用不同浓度DHA(6.25和12.5 g/kg)灌胃小鼠,分别于0,1,2,4,8,16和24 h处死,取脂肪组织和肝脏,提取总RNA,半定量(semi-quantitative,SQ)RT-PCR方法检测生脂及脂解基因PPARγ、SREBP-1c、FAS,及脂解相关基因HSL和TGH的时序表达规律。【结果】脂肪组织中DHA均可促进PPARγ、FAS、HSL和TGH基因的转录表达,8 h达到峰值,其后表达量下降;抑制SREBP-1c基因的表达,8 h达到最低,之后上升。肝脏中DHA均可抑制PPARγ、SREBP-1c、FAS和HSL基因的转录表达,且表达量分别于8,8,8和16 h达到最低,之后表达量上升;DHA对TGH的作用不显著(P>0.05)。【结论】DHA通过促进脂肪组织中脂肪分解及抑制肝脏中脂肪合成与分解来调节动物体脂沉积。     

miR-127-3p对C2C12细胞成肌分化和转录组的影响

前期研究表明,miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调控,但对于miR-127-3p调控的靶基因及其在成肌分化中的作用还不清楚。应用qRT-PCR与细胞形态学方法研究过表达miR-127-3p对C2C12成肌细胞分化及成肌标志基因MyoD、MyoG和Myosin表达的影响;RNA-Seq分析过表达miR-127-3p对成肌细胞转录组的影响,鉴定差异表达基因并对其功能进行初步研究。结果表明,过表达miR-127-3p显著促进C2C12细胞的成肌分化与MyoD、MyoG和Myosin表达;RNA-Seq分析共鉴定到3个差异基因,均为下调基因,其中包括2个转录因子(Irf7和Ddit3)。GO与KEGG分析显示,这些差异基因显著富集于免疫和能量代谢过程/信号通路。生物信息学分析发现,miR-127-3p可与Ddit3基因的CDS区发生碱基互补配对,进而抑制其表达。表明在转录组水平上,miR-127-3p可能通过直接靶向Ddit3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达,进而调节成肌细胞分化。     

猪源Lin28基因的克隆及其在猪胎儿成纤维细胞中的表达

Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子.根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列.将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28.在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts, PEF).免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达.     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

用cDNA微阵列分析水稻防卫反应及信号传导相关基因

应用cDNA微阵列技术分析了水稻受白叶枯菌侵染后一对近等基因系(中早14R、9S)的防卫信号传导途径.在mRNA 水平,对检测到的相关基因(如病程相关蛋白、信号传导、转录因子等)间相互作用及信号传导途径的分析结果表明:白叶枯菌侵染下,乙烯(ET)介导的信号传导途径在防卫反应中可能起着重要作用.核基因接受信号后改变了一些防卫反应相关基因的表达水平,来应答病原物的侵入.实验结果还提示,水稻的一些基因通过表达丰度的改变对乙烯信号途径产生反馈调节.     

PI3K信号通路关键基因在猪卵泡发育中的表达规律

【目的】研究不同时期猪卵巢卵泡发生的形态特征及磷脂酰肌醇3–激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路关键基因在卵泡发生发育中的作用。【方法】通过HE染色观察12日龄、30日龄、70日龄、20月龄卵泡期及黄体期、48月龄的长大二元母猪卵巢卵泡发育的形态变化,应用实时荧光定量PCR检测PI3K通路关键基因在这些时期的表达规律,并通过Western blot法检测PI3K通路重要的下游效应因子p-rpS6在不同时期猪卵巢的表达情况。【结果】12日龄母猪卵巢皮质边缘有大量的原始卵泡,皮质与髓质交界处可见少量初级卵泡及个别的次级卵泡;30日龄母猪卵巢次级卵泡数量增加;70日龄出现3级卵泡;20月龄卵泡期、黄体期分别有大量成熟卵泡、大体积的黄体;48月龄较难观察到原始卵泡。PI3K通路抑制因子PTEN、TSC1、TSC2与激活因子PDK1、AKT1、mTOR的mRNA均在12日龄表达量最高,70日龄、48月龄表达量次之,30日龄和20月龄表达量最低;下游效应基因rpS6的mRNA 30日龄表达量最高,20和48月龄表达量最低,p-rpS6蛋白在12日龄、20月龄、48月龄母猪卵巢高表达,在30日龄、70日龄中几乎不表达。【结论】PI3K通路关键基因在不同时期母猪卵巢中的表达水平不同,说明该通路参与了猪卵泡的早期发生及卵泡成熟的调控过程。     

Progress,problems and prospects of porcine pluripotent stem cells

Pluripotent stem cells (PSCs), including embryonic stem cells (ESCs) and induced PSCs (iPSCs), can differentiate into cells of the three germ layers, suggesting that PSCs have great potential for basic developmental biology research and wide applications for clinical medicine. Genuine ESCs and iPSCs have been derived from mice and rats, but not from livestock such as the pig—an ideal animal model for studying human disease and regenerative medicine due to similarities with human physiologic processes. Efforts to derive porcine ESCs and iPSCs have not yielded high-quality PSCs that can produce chimeras with germline transmission. Thus, exploration of the unique porcine gene regulation network of preimplantation embryonic development may permit optimization of in vitro culture systems for raising porcine PSCs. Here we summarize the recent progress in porcine PSC generation as well as the problems encountered during this progress and we depict prospects for generating porcine naive PSCs.     

当归多糖对点带石斑鱼Toll样受体22信号通路相关基因表达的影响

为研究当归多糖Angelica sinensis polysaccharide(ASP)对点带石斑鱼Epinephelus malabaricus Toll样受体22(Toll-like receptor 22,TLR22)信号通路相关基因表达的影响,以当归多糖体外孵育点带石斑鱼头肾白细胞,采用实时荧光定量PCR(q PCR)方法检测了不同时间点(3、6、12、24、48 h)TLR22信号通路相关基因m RNA相对表达量的变化。结果表明:TLR22及与其接头的Toll样接头蛋白1(TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β,TRIF)的表达量均随时间的延长逐渐升高,分别于24、12 h达到峰值;TRIF下游的干扰素调节因子(Interferon regulatory factor 3,IRF3)在24 h表达量达到最大值,此时主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)与肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达量也开始到达峰值;白介素-8(Interleukin-8,IL-8)的表达量在48 h达到最高。研究表明:当归多糖可激活TLR22及其下游相关基因,并在免疫调节过程中起到重要作用。     

牛抵抗素对牛肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88非依赖信号通路基因表达的影响

旨在探究牛抵抗素通过TLR4/MyD88非依赖信号通路诱发牛肺泡巨噬细胞的相关炎症反应机理。使用100 ng·mL^-1终浓度牛抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞,分别在0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h时采用qRT-PCR检测TLR4/MyD88非依赖信号通路相关基因(TLR4、TRAM、NF-κB)mRNA水平表达量,通过ELISA法检测下游IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达水平。结果显示,100 ng·mL^-1牛抵抗素处理牛肺泡巨噬细胞后,TLR4、TRAM、NF-κB基因表达量于6.0 h时极显著上调(P<0.01),诱导12.0 h时,相关基因表达量达到最高;IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子于1.5 h表达量极显著上调(P<0.01),且均存在时间依赖效应。抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞后,可激活TLR4/MyD88非依赖信号通路,通过信号传递,释放大量促炎细胞因子,引起肺部炎症。     

杜仲幼果和叶片MVA途径基因表达差异分析

【目的】杜仲橡胶是一种多萜类物质,而甲羟戊酸(MVA)途径是合成萜类物质的重要途径之一。分析杜仲MVA途径相关基因表达的差异,预测杜仲橡胶合成的主要上游途径。【方法】在杜仲幼果和叶片转录组测序的基础上,根据基因功能注释和表达分析,确定MVA途径的系列基因,并对其进行表达差异分析。【结果】杜仲橡胶合成的MVA途径共涉及23条Unigene,分别为3条EuACOT、3条EuHMGS、8条EuHMGR、2条EuMK、1条EuPMK和6条EuMDP基因。根据转录组RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)数据对基因表达差异进行分析,结果表明杜仲MVA途径中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在幼果和叶片中的表达量具有显著差异,其中仅EuMDP9在叶片中的表达量大于幼果,而其余基因在幼果的表达量大于叶片;EuHMGR15和EuHMGR17只在幼果中特异表达。【结论】MVA途径绝大部分基因在果实中大量表达,这与果实中杜仲橡胶含量远超过叶片的现象相吻合,推测杜仲果实MVA途径为杜仲橡胶合成的主要途径。     

猪BMSCs成脂分化中细胞膜钙离子通道、钙敏感受体及成脂定向相关基因表达研究

【目的】研究猪骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化为脂肪细胞过程中细胞膜上钙离子通道、钙敏感受体(Calcium-sensing receptor,Ca SR)基因及成脂定向相关基因的表达。【方法】从5~7日龄仔猪骨髓中分离纯化出猪BMSCs,诱导猪BMSCs成脂分化。油红O法和三酰甘油法检测细胞分化聚酯状况。在成脂分化不同时间(0、1、2、5和10 d)收集细胞,利用荧光定量PCR检测锌指蛋白423(Zinc finger protein423,Zfp423)、脂肪前体细胞因子(Preadipocyte factor 1,Pref-1)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、骨形态发生蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)、细胞膜钙离子通道及Ca SR基因的mRNA表达变化。【结果】油红O染色和三酰甘油检测结果表明,成功诱导猪BMSCs成脂分化;定量PCR结果显示,在猪BMSCs成脂分化第5天,成脂定向标志基因Zfp423、脂肪前体细胞标志基因Pref-1及促进成脂分化基因BMP2、BMP4的mRNA相对表达量显著提高(P0.05),说明第5天是猪BMSCs成脂定向形成脂肪前体细胞的关键时期;同时,细胞膜上的电压门控钙离子通道亚基电压依赖型α/δ亚型1(Voltage-dependentalpha-2/delta subunit 1,CACNA2D1)、钙释放激活钙通道调节分子1(Calciumr elease-activated calcium channel modulator 1,Orai1)、瞬时受体电位通道传统型1(Transient receptor potential canonical type 1,TRPC1)、瞬时受体电位通道M型7(Transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)、瞬时受体电位通道香草素受体亚型1(Transient receptor potential vanilloid receptor1,TRPV1)基因和Ca SR基因在诱导成脂第5天mRNA相对表达量也显著提高(P0.05),提示细胞膜钙离子通道及Ca SR基因可能参与了猪BMSCs成脂分化过程。【结论】揭示了猪BMSCs成脂分化过程中细胞膜钙离子通道、钙敏感受体及成脂定向相关基因的表达模式。