鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

新城疫病毒HN09-69株P基因的克隆、序列分析及表达

【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21（DE3）中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基因的ORF,序列长度为1 188 bp。NDV HN09-69株核苷酸与弱毒株La Sota、clone-30同源性分别为82.5%和82.4%,与强毒株F48E8同源性为84.9%,与鸭源,鹅源NDV核苷酸同源性分别为97.9%～98.4%和96.0%～98.0%。SDS-PAGE电泳和Western blotting检测结果表明,重组P蛋白分子质量约为54 ku,符合预期结果,在大肠杆菌中主要以可溶性的形式表达。【结论】NDV HN09-69株与SDWF-02和SD-09鸭源强毒分离株同源性高,亲缘关系近。重组P蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析

【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

猪传染性胃肠炎病毒HN-2012分离株M基因遗传变异分析及其真核表达研究

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株的M基因为模板,设计了1对特异性引物,扩增了M基因,经克隆测序后,将该基因序列与NCBI中TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析。将M基因亚克隆至真核表达载体p CAGGS-M-flag中,转染293T细胞,利用flag标签抗体进行Western blot检测分析。结果表明,TGEV HN-2012株的M基因与其他毒株间核苷酸的同源性分别为94.8%~99.0%,与中国其他毒株关系较远。Western blot结果可见大小约为29.5 k D的目的条带,表明M基因成功的在293T细胞中表达。     

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。     

新城疫病毒分离株P基因的分子特性和遗传进化

【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)磷蛋白基因(P基因)的分子进化特点,为科学防控新城疫(Newcastle disease,ND)提供依据。【方法】对1997~2007年国内分离的13个NDV毒株的P基因进行扩增测序,与15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株P基因进行核苷酸和推导的氨基酸遗传变异分析及分子特性研究。【结果】国内NDV分离株P基因核苷酸和P蛋白氨基酸高度同源,同源性分别为93.9%~99.8%和93.4%~99.2%。国内NDV毒株与LaSota、Clone30和F48E9等P基因核苷酸和P蛋白氨基酸同源性分别为82.2%~87.7%,81.3%~83.8%;与国外毒株则分别为82.1%~90.2%,81.1%~90.7%。氨基酸序列分析表明,我国毒株具有独特的氨基酸位点。分子进化分析表明,NDVP基因中核苷酸同义替代率高于非同义替代率。【结论】国内分离NDV毒株P蛋白遗传距离较近,而与LaSota、Clone30、F48E9以及国外毒株遗传距离较远,有一定的地域性。NDVP基因以净化选择的方式进化。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

鹿结核病流行株与卡介苗差异基因原核表达质粒的构建及表达

以吉林农业大学经济动物疾病实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株的基因组为模板,应用PCR方法从已构建的鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因文库中扩增RD1区的Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875和Rv3878 5段目的基因,分别与p MD18-T Simple Vector连接,经PCR、酶切鉴定后的阳性重组克隆质粒与原核表达载体p GEX-4T-1连接并进行原核表达,采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物的反应原性进行初步研究。基因测序结果显示差异基因与期望的序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达,获得以可溶形式表达的目的蛋白,经SDS-PAGE分析目的蛋白的相对分子量与理论值相符,经Western blot鉴定纯化好的目的蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,为其在鹿结核病血清诊断学中的应用奠定了试验基础。     

草鱼出血病病毒血凝作用及影响因素

为了探明草鱼出血病病毒的血凝作用及其影响因素，应用血凝试验对此进行了测定，结果表明：病毒只对鸡红细胞引起高滴度凝集，这种凝集能被特异性抗血清所抑制；血凝的适宜pH为5.5-7.0,2%的氯化钠为较适宜的稀释液，血凝活性以在37℃温度条件下最好；出血病病鱼肠道的凝集价量高；醛化的鸡红细胞的4℃下保存一年多仍具有新鲜红细胞表面受体活性，从而使草鱼出血病的HA和HI试验更具有稳定性和广泛的实用性，建立了一种快速诊断草鱼出血病的方法。     

应用间接血凝试验检测牛肺疫抗体

自制1.5％绵羊红细胞诊断液并用于检测牛肺疫抗体,结果如下:(一)三批标准阳性血清(批号为8601、8301、8001)凝集价均在160倍以上,标准阴性血清(批号为8601)凝集度仅为10倍。15份被检血清IHA的阳性检出率(8/15)高于补体结合反应(CF,6/15)且凝集价均在40倍以上。(二)用牛肝片吸虫病、布氏杆菌病和附红细胞体病阳性血清作类症鉴别诊断,凝集度仅为10倍。(三)把牛肺疫CF8502抗原作倍比稀释,加2个凝集单位牛肺疫阳性血清8601和8301进行间接血凝抑制试验,分别被32倍和16倍稀释的抗原所抑制,本项试验结果表明IHA用于检测牛肺疫,具有检出率高、特异性强、设备要求简单、容易操作等特点,适于在现地推广应用。     

影响血凝抑制试验因素的研究进展

血凝抑制试验(HI)在畜牧业生产中应用非常广泛,但是影响其试验结果的因素较多.对红细胞、抗原、血清、稀释液、温度、作用时间及判定时间、试验器材、试验方法、判定方法和操作等因素对HI试验的影响进行了概述,以期能对生产应用提供参考.     

鸡非典型新城疫的诊断报告

对某鸡场因不明原因已死亡及濒死产蛋鸡进行病理剖检变化及实验室诊断，确诊为鸡非典型性新城疫．抗体检测的结果显示，随机抽样检测32份鸡血清的新城疫血凝抑制效价在1：40～1：2560之间，表明该鸡场的鸡群存在野毒感染．     

应用间接血凝试验检测血吸虫抗体

本试验以日本血吸虫水溶性虫卵抗原致敏醛化红血球,建成了检测日本血吸虫抗体的间接血凝试验。应用该法观察血吸虫抗体的消长规律,结果表明:抗体最早于人工感染血吸虫尾蚴后25天出现;吡喹酮治疗后5个月转阴。     

鲍氏不动杆菌MF1株的粘附特性

取从患病鳜鱼体内分离到的鲍氏不动杆菌 Ｍ Ｆ１株和３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ不动杆菌参考株做血凝试验（ Ｈ Ａ）,１３种不同动物的红细胞对４株不动杆菌的血凝特性分析结果表明,鲍氏不动杆菌（ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍ ａｎｎｉｉ） Ｍ Ｆ１株能凝集人 Ｏ 型血以及鸡、鼠、绵羊、鲢、黄鳝等５种动物的红细胞, 不凝集鳜、罗非鱼、鲫、团头舫、鲤、欧洲鳗、鳙的红细胞, 且该种血凝不能被甘露糖抑制; 其它３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ参考菌株对１３种红细胞均不能发生凝集。４株不动杆菌的粘附实验表明, Ｍ Ｆ１株可以粘附 Ｈ Ｅｐ２细胞, 每细胞粘附菌在２０个以上, 菌体粘附于细胞四周; ３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ不动杆菌参考株对 Ｈ Ｅｐ２细胞不具粘附特性。以上４株不动杆菌对 Ｅ Ｐ Ｃ细胞 （鲤鱼乳头状上皮瘤细胞系） 均无粘附性。     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的研究

将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,和致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,用于检测血清中的抗副猪嗜血杆菌抗体的效价。实验表明该法操作简便,特异性强,不与其他传染病阳性血清发生交叉凝集。     

伪狂犬病毒血凝及血凝抑制试验

对两株伪狂犬病毒在４、２８、３７℃下进行血凝试验（ＨＡ）和血凝抑制试验（ＨＩ）。试验结果表明，伪狂犬病毒能够凝集小白鼠红血球，ＨＡ可被抗伪狂犬病毒的高免血清特异性抑制（１：６４）。并不受温度的影响。因此，该方法是诊断伪犬病的一种快速、简便、易于推广的方法。     

猪细小病毒N株耐热性研究

观察不同温度对猪细小病毒N株血凝活性的影响.结果表明,猪细小病毒N株在37℃条件下十分稳定,作用28d血凝滴度变化不大,只下降1～3个滴度;在60℃恒温水浴下的血凝滴度变化缓慢,血凝滴度在前7d-直稳定;随着温度的升高,病毒血凝的稳定性迅速降低,短时间内即可失去血凝活性,在75℃1h、80℃10min、85℃5min,检测不出病毒血凝活性.由此证明,猪细小病毒N株在37、60℃时血凝活性十分稳定,对热有很强的抵抗力,为将该弱毒株开发成方便运输、保存和使用的疫苗提供了依据.     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的制备

【目的】建立一种便于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法。【方法】将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,检测该诊断液的活力及特异性。【结果】该诊断液特异性强,仅与副猪嗜血杆菌5型阳性血清发生凝集反应。活力也比较高,达到1:512以上,可以用其进行副猪嗜血杆菌疫苗免疫后抗体检测。【结论】该间接血凝诊断液成功制备为广大兽医化验人员提供一种简单、快速、经济的检测副猪嗜血杆菌抗体的方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断和防治提供一种有效的手段