新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库多样性的生物信息学分析

[目的]骆驼免疫系统中只存在重链抗体,其可变区VHH片段是最小的天然抗体片段.通过对双峰驼VHH基因进行序列分析,了解双峰驼VHH基因特征,分析VHH文库多样性组成.[方法]采用新疆双峰驼VHH特异引物扩增全部抗体基因片段,连接到M13噬菌粒载体上,与pⅢ蛋白融合表达在噬菌体表面,构建噬菌体展示文库.基因测序和菌落PCR方法,分析文库大小和阳性克隆插入率.NCBI-IgGBLAST工具对抗体序列进行IMGT编号命名,WebLogo工具分析抗体保守序列分布频率,MEGA6软件对VHH序列进行同源性比对和系统进化树构建.[结果]利用免疫的新疆双峰驼淋巴细胞,构建了库容量为1.4 ×109的VHH抗体噬菌体展示文库.对91个随机挑选的文库TG1单菌落进行PCR.结果表明该文库VHH阳性插入率为97;,DNA测序表明文库多样性为97.8;.对91个克隆DNA测序结果进一步分析表明,这些基因中除2个为常规VH抗体外,其余均为重链VHH抗体.根据抗体序列中的特征氨基酸分布,将91个抗体序列划分为7个亚群.[结论]构建的新疆双峰驼VHH文库多样性较好,生物信息学分析揭示出文库中多样性克隆的分布和特征,有助于新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库的进一步构建.     

单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定

优化噬菌体展示文库构建策略,获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量进行鉴定.分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)基因,插入T7 select 415-1b噬菌体载体构建文库,计算文库的库容量,测定文库传代稳定性.测序分析VHH基因的多样性和纳米抗体氨基...     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。     

抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼，采集全血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录，巢式PCR扩增VHH基因，构建VHH噬菌体文库，利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10⁸的VHH噬菌体文库，然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，特异性VHH噬菌体得到明显富集，氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体，分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性，其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力，为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。     

鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。     

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

[目的]构建PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础.[方法]分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接头,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNA T7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量.[结果]经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度达6.0× 1010 PFU/mL.PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95.83%,且插入片段主要分布于500~2000 bp,其中500~750 bp的占21.73%,750~100 bp的占21.73%,1000~2000 bp的占39.13%.随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列.[结论]构建的PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用.     

抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌鼠源化噬菌体抗体库的构建及筛选

用灭活的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌免疫小鼠后,取出小鼠脾脏提取总RNA,以RT-PCR扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将VH和VL拼接成ScFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,构建鼠源抗金黄色葡萄天然噬菌体抗体库。研究结果表明,构建的鼠源性抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库库容为3.2×106,多样性良好,共筛选出8个阳性克隆。说明已成功构建抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库,为筛选有效治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选

旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选。采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达。采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性。得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性。说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

Development of a sandwich Dot-ELISA for detecting bovine viral diarrhea virus antigen with E2 recombinant protein

The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO₄. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL⁻¹, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and 45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL⁻¹. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were 90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily interpreted without an ELISA reader.     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研制

将含有牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)囊膜糖蛋白E2编码基因的真核表达质粒pEC143免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组E2蛋白纯化产物为检测抗原,经间接ELISA法筛选和3次有限稀释法克隆,得到1株能稳定分泌抗BVDV1和BVDV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该3D8株单抗能识别BVDV1标准毒株(NADL、OregonC24V)、BVDV2标准毒株(890、104)、2株BVDV1分离株和3株BVDV2分离株,而不能识别牛轮状病毒、牛疱疹病毒1型,显示出良好的特异性.阳性杂交瘤细胞的上清液、腹水ELISA抗体效价分别为2~9和10×2~7,为IgM亚类.其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得,为建立单抗介导的检测BVDV1和BVDV2抗原和抗体的血清学方法和实现标准化诊断奠定基础.     

乌梁素海湖滨湿地硫酸盐还原菌种群分布

采用克隆文库构建和实时定量PCR技术,对乌梁素海湖滨湿地小河口陆向演化芦苇沉积物、湖滨沼泽水葱沉积物、湖滨碱蓬盐碱化草甸土壤、湖岸白刺荒漠化土壤等环境中硫酸盐还原菌(sulfate reducting bacteria,SRB)多样性及其丰度进行了研究。结果显示:上述沉积物和土壤环境中硫酸盐还原菌功能基因apsA丰度存在显著差异,每克土壤中基因丰度(拷贝数)分别为1.34×10~7、8.07×10~5、5.27×10~6和2.37×10~4;系统发育树分析表明,硫酸盐还原菌属于变形杆菌门(Proteobacteria)中的五个科,分别为Acidithiobacillales、Desulfurella、Chromatiales、Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae,其中Chromatiales、Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae为优势菌群。沉积物和土壤环境中硫酸盐还原菌群落及apsA基因丰度存在显著差异,硫酸盐还原菌多样性与土壤总盐量、含水率及硫酸盐浓度之间存在显著相关(P0.05)关系。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

 【目的】构建单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交     

泗顶矿区植物根际和非根际土壤反硝化细菌群落特征

为了探讨植物种类和土壤性质如何影响重金属污染严重矿区的土壤反硝化过程,本研究以广西柳州泗顶铅锌矿区上游、尾矿和下游3个区域优势植物——蜈蚣草、芦苇和五节芒的根际和非根际土壤为研究对象,采用高通量测序技术和荧光定量PCR技术,分析了3种优势植物根际和非根际土壤中nirK型和nirS型反硝化细菌的群落结构、丰度和多样性特征。结果表明：罗河杆菌属(nirS型)和慢生根瘤菌属(nirK型)为根际和非根际土壤中的优势菌属,所占比例分别为2.6%～67.8%和4.1%～38.1%。尾矿区根际及非根际土壤中nirS和nirK基因的丰度范围分别为1.45×10⁶～7.78×10⁶基因拷贝数·g^-1(以干土计)和1.10×10⁶～5.70×10⁶基因拷贝数·g^-1,显著低于上游区和下游区(P<0.05)。3种优势植物根际土壤的Shannon指数和ACE指数均大于非根际土壤。多元线性回归分析和Mantel检验表明,土壤含水率、总碳、总氮和总磷含量是影响泗顶矿区3种优势植...