奶牛肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

为建立奶牛肾小管上皮细胞的原代培养、传代以及鉴定方法,本研究将肾脏皮质剪碎,并网筛过滤选取肾小管后分别进行直接培养、胶原酶1消化培养、胰蛋白酶消化培养和胰蛋白酶和0．02％EDTA混合消化培养,分别应用上述四种方法进行原代培养和传代培养,然后采用CK-18、PCK和Vimentin三种蛋白进行免疫组化鉴定奶牛肾小管上皮细胞。结果表明,采用消化培养方法都能够得到奶牛肾小管上皮细胞,但是胶原酶1消化得到的活细胞更多,能更快地成功培养奶牛肾小管上皮细胞。胶原酶1消化法是培养奶牛肾小管上皮细胞的理想培养法。     

镉对体外培养大鼠肾小管上皮细胞的毒性损伤及乙酰半胱氨酸的保护效应

在建立肾小管上皮细胞体外培养模型的基础上,通过在培养液中添加不同浓度的醋酸镉和乙酰半胱氨酸(NAC),用CCK-8法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞内活性氧与线粒体膜电位,探讨了镉对体外培养大鼠肾小管上皮细胞的毒性损伤及NAC的保护效应。结果显示,作用12 h,各染毒组与对照组相比,细胞存活率和线粒体膜电位显著下降(P0.05或P0.01),细胞凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和细胞内活性氧含量均显著升高(P0.05或P0.01),呈剂量-效应关系;而NAC保护组与染毒组相比,细胞存活率和细胞凋亡率均有显著差异(P0.05),细胞坏死率无明显差异(P0.05)。结果表明,本试验所选择的镉浓度引起的肾小管上皮细胞死亡是以凋亡为主,氧化应激直接参与镉对肾小管上皮细胞的毒性损伤,NAC对肾小管上皮细胞凋亡有一定的保护效应。     

马兜铃酸Ⅰ诱导肾小管上皮细胞凋亡的检测

本试验旨在培养小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAⅠ)诱导小鼠肾小管上皮细胞的凋亡情况。AAⅠ与RTECs反应后,从细胞形态学、DNA Ladder、流式细胞仪3个方面检测AAⅠ诱导RTECs的凋亡情况。AAⅠ作用后,随着浓度的增高,上皮细胞失去上皮细胞表型,在20~80 μg/mL作用24 h后,细胞都出现晚期凋亡的特征;在20 μg/mL AAⅠ的作用下早期凋亡的比率随作用时间的延长而增高。AAⅠ可诱导小鼠原代RTECs产生凋亡,凋亡随着作用时间的延长和药物浓度的增大而加剧。     

细胞外高钙对鸡肾小管上皮细胞活力和NO产生的影响

为探讨一氧化氮（NO）在高钙致鸡痛风中的作用，利用已建立的鸡原代肾小管上皮细胞的体外研究模型，经不同浓度的钙进行处理．通过MTT比色法观察了高钙对细胞活性的影响；采用硝酸还原酶法测定了不同浓度高钙处理原代肾小管上皮细胞后培养上清液中亚硝酸根／硝酸根（NO2^-／NO3^0）的含量（NO的静态氧化形式）。结果表明，分别用4．0mmol／L（试验组Ⅰ），8．0mmol／L（试验组Ⅱ），12．0mmol／L（试验组Ⅲ），16．0mmol／L（试验组Ⅳ）Ca^2＋处理细胞，各时段组的细胞活性与对照组相比均显著降低（P〈0．01），且细胞外钙浓度越高，细胞活性降低越明显。高钙处理细胞24h后．各组培养液中NO的含量较对照组升高不显著；48h后，试验Ⅳ组的NO比对照组显著升高；72h后，各试验组与对照组相比NO的含量均显著升高。这些结果说明，细胞外高钙能够直接损害肾小管上皮细胞，而NO可能在肾小管上皮细胞的损害中起一定的作用。     

庆大霉素致原代大鼠肾小管上皮细胞凋亡的研究

为了探究庆大霉素致原代肾小管上皮细胞的凋亡作用,以0、1、2、4、8、16 mmol/L浓度的庆大霉素分别作用原代大鼠肾小管上皮细胞24 h,采用cck-8法检测细胞相对活力,hochest 33258染色法观察细胞核形态以及利用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明,与对照组相比,随着庆大霉素浓度的增加,细胞活性呈显著或极显著下降(P0.05或P0.01),细胞凋亡率呈显著或极显著上升(P0.05或P0.01),hochest33258染色观察到细胞核出现固缩或碎裂(P0.01)。结果提示,庆大霉素能引起细胞发生凋亡和损伤,并且这可能与其肾毒性有密切的联系。     

TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测

采用肾小管节段贴块法培养小鼠原代肾小管上皮细胞,用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞种类,并用RT-PCR检测了原代肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7基因的表达情况.结果表明,TGF-β1、Smad4和Smad7基因在肾小管上皮细胞中均有表达.这为探讨上述基因在肾间质纤维化中的作用奠定了基础.     

细胞外高钙对鸡肾小管上皮细胞活力和NO产生的影响

为探讨一氧化氮(NO)在高钙致鸡痛风中的作用,利用已建立的鸡原代肾小管上皮细胞的体外研究模型,经不同浓度的钙进行处理,通过MTT比色法观察了高钙对细胞活性的影响;采用硝酸还原酶法测定了     

Arkadia表达载体转染肾小管上皮细胞条件的优化

本试验旨在优化泛素化酶Arkadia质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo转染小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)的条件,为研究Arkadia表达载体在小鼠马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。以小鼠RTECs为转染对象、脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质,采用Real-time PCR和CCK-8法检测不同的质粒与脂质体比例条件下Arkadia mRNA的表达差异及对细胞活性的影响;同时,用Real-time PCR检测不同的转染时间条件下表达载体对Arkadia mRNA沉默效果的差异。结果显示,Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体的转染效率表现出了一定的剂量和时间依赖性。当质粒DNA∶Lipofectamine^TM 2000为0.66 μg∶2 μL、转染时间为24 h时,对Arkadia mRNA表达的抑制最明显并且对细胞的毒性最小。最终确定了Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体转染小鼠RTECs的最佳条件。     

磷酸铵镁对羊肾小管上皮细胞的损伤作用

为了研究磷酸铵镁(MAP)对羊肾小管上皮细胞(RTECs)的损伤作用,取20份结石羊尿沉渣进行镜检,并观察肾脏组织病理变化;其中在14份尿沉渣中观察到磷酸铵镁晶体,肾组织结构严重受损,RTECs变性坏死。观察尿结石羊症状并采集样品进行实验室检测。胶原酶组织块消化法分离培养羊RTECs,角蛋白18进行鉴定。MAP分别处理羊RTECs 12,24和48 h, CCK-8法检测羊RTECs的活力,Western blot法检测羊RTECs NF-κB信号通路的表达及Caspase-3、Bcl-2和Bax的水平,ELISA法检测细胞上清中IL-6和TNF-α的水平及LDH表达量。结果显示,尿结石羊尿液pH值比健康羊高,血液和尿液镁离子和磷离子水平也明显升高。胶原酶消化能获得较多且完整的肾小管节段,12 d左右细胞融合达80%～90%,呈典型的铺路石状,纯化后95%以上细胞CK-18鉴定为阳性。MAP能显著降低羊RTECs的活力,使IL-6和TNF-α的表达增加,细胞LDH含量增多。MAP组羊RTECs p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白相对表达量增加,凋亡蛋白Caspase-3的表达明显...     

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。     

鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形"铺路石样"的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。     

茯苓多糖对磷酸铵镁致羊肾小管上皮细胞损伤的保护作用

氧化损伤在结石的形成过程中具有重要作用。茯苓多糖(PCP)具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种作用。本研究探讨PCP对磷酸铵镁(MAP)诱导的羊肾小管上皮细胞(RTECs)炎症和氧化应激的影响。结果显示,PCP显著减轻MAP诱导的氧化应激,表现为乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平降低,超氧化物歧化酶(SOD)活性升高。PCP抑制MAP对炎症细胞因子IL-6和TNF-α的诱导作用。Western blot试验显示,PCP能增加Nrf2、 HO-1和NQO1的表达。综上所述,PCP通过提高细胞Nrf2、NQO1、HO-1的表达水平,从而对MAP诱导的肾小管上皮细胞氧化应激和炎症起到保护作用,这为羊尿结石的中药防控提供了依据。     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养

目的：建立荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。方法：采用组织块种植法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用胰蛋白酶差时消化法分离、纯化上皮细胞。结果：成功培养出奶牛乳腺上皮细胞,显微镜下观察,纯化的乳腺上皮细胞呈典型上皮细胞形态,细胞之间排列紧密,呈鹅卵石铺路样,形态均一,多角形的单层聚集。通过荧光免疫细胞染色方法对细胞骨架蛋白-角蛋白18进行鉴定,呈现阳性反应。乳腺上皮细胞增殖旺盛,经25次以上传代后长势仍然良好。结论：采用组织块种植法结合胰酶差时消化法成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。     

奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的体外培养与鉴定

为体外培养纯化出稳定的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,试验通过外科手术的方法取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织,分离乳腺腺泡,用组织块法体外培养奶牛乳腺细胞,应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别纯化出来,并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行鉴定。结果表明:纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样生长,并可分泌乳滴,角蛋白-18反应阳性,波形蛋白反应阴性;纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形,呈旋涡状或放射状生长,角蛋白-18反应阴性,波形蛋白反应阳性;经纯化后2种细胞的纯度均可达95%以上,可满足后续试验的要求。     

Positive correlation between renal tubular flattening and renal tubular injury/interstitial fibrosis in murine kidney disease models

The number of patients with chronic kidney disease (CKD) is growing continuously globally. In order to study pathogenesis and mechanisms, many animal models have been developed, including spontaneous, genetic, and induced models. Although each type of CKD shows disease-specific tissue changes in the early stages, tubular disorder and interstitial fibrosis histologically occur in the course of progression to end-stage renal failure. Therefore, the quantification of tubular disorder and interstitial fibrosis in CKD research using animal models is essential for measuring the degree of CKD severity and, thus, efficacy of therapeutic agents. Several strategies have been used to quantify interstitial fibrosis. Among scoring factors, renal tubular flattening can be quantitatively evaluated easily and inexpensively. However, the diagnostic value of renal tubular flattening evaluation has not been investigated previously. Therefore, in this study, we investigated the correlation between renal tubular flattening and interstitial fibrosis or renal tubular injury markers. We observed a strong correlation between the degree of tubular injury/interstitial fibrosis and renal tubular flattening in three types of mouse renal disease model. This is advantageous because rapidly advancing technologies such as artificial intelligence and image processing can be easily applied; hence, a more precise, objective, and quantitative diagnosis should be possible in the future.     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

为了对牛乳腺上皮细胞(MECs)进行分离、培养和鉴定,并研究细胞分泌功能,试验通过胶原酶消化法分离得到了牛乳腺上皮细胞,采用传代法对细胞进行纯化,对细胞标志蛋白进行免疫荧光染色鉴定,通过体外诱导和RT-PCR分析鉴定细胞的分泌功能。结果表明:分离到的牛乳腺上皮细胞具有典型乳腺上皮细胞的形态特征,表达广谱角蛋白,经诱导后可分泌β-酪蛋白。     

A long-term in vitro culture of bovine epithelial cells on collagen rafts

In the present work, we established and characterized a 3D functional polarized primary bovine oviduct epithelial cells (BOECs) culture on free-floating type I collagen hydrogels (rafts) at an air-liquid interface (ALI). Intercellular junctions, ultrastructural cellular morphology and the expression of the OVGP1 closely recapitulated those of the in vivo epithelium lining. These morphological and physiological epithelial cell features were maintained under standard DMEM/F12 with 10% foetal bovine serum culture medium for at least 28 days of ALI culture. The versatility of the BOECs raft cultures should allow testing of toxicity compounds, in vitro evaluation of physiological or pathological oviductal states, and the study of epithelial-mesenchymal interactions that are critical for the maintenance of oviductal homeostasis.     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。