4-乙氧基-7-羟基香豆素及其衍生物的合成

以间二酚和氰基乙酸为主要原料,经Pechmann反应、水解、乙醚化、Williamson反应合成了9种7-烷氧基-4-乙氧基香豆素类新化合物.Williamson反应的优化条件为:N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 为溶剂,n(4-乙氧基-7-羟基香豆素) :n(卤代烃) :n(碳酸钾) :n(TBAB,四正丁基溴化铵) =1:1.5:2.5:0.1,60～80℃反应11～25 h,产率为72%～95%.中间产物及目标产物结构经红外光谱(IR) 、质谱(MS) 、核磁共振氢谱(1H NMR) 表征得以证实.     

2，2-二（3-溴-4-羟基-5-硝基苯基）丙烷的合成及结构表征

以双酚A为起始原料．经过硝化、溴代反应，合成了2.2-二(3-溴-4-羟基-5-硝基苯基)丙烷，产率为83．1％．由IR、1HNMR、13CNMR和MS对目标产物的结构进行表征．所得数据与产物结构相符。     

7-羟基异黄酮类化合物的"一锅法"合成及其糖苷化反应研究

以间苯二酚和芳乙酸为原料,用三氟化硼乙醚作溶剂和催化剂,在C1试剂DMF/PCl5体系中,以90%以上产率"一锅法"合成了4个7 - 羟基异黄酮类化合物1a～1d.将1a在DMF/丙酮(3∶2 V/V)混合溶剂中,以K2CO3为碱性缩合剂、四丁基溴化铵(TBAB)为相转移催化剂,分别与α - 溴代乙酰半乳糖和α - 溴代乙酰麦芽糖发生糖苷化反应,以及随后在氨水存在下的脱乙酰基反应,得到了2种未见文献报道的新型7 - O - β - D - 异黄酮苷化合物2～3. 所合成的产物已通过MS,1HNMR和IR等波谱方法进行了结构确认. 该合成方法具有反应条件温和,后处理方便,产率较高和立体选择性强的优点,具有较大的应用价值.     

7，3＇，5＇-三取代黄烷酮和黄酮醇类化合物的合成

以3,5-二羟基苯甲酸和间苯二酚为原料,分别经酯化、乙酰化、甲氧甲氧基保护或甲基化、酰肼化、氧化、醛酮缩合、环化、Algar-Flynn-Oyamada反应以及脱保护基等步骤,以21%~32%的总收率合成了7,3’,5’-三取代黄烷酮1a~1b和黄酮醇类化合物2a~2b,所有合成产物通过1H NMR,IR,MS进行了结构确证.其中黄烷酮1b是从药用植物中间锦鸡儿Caragana intermedia Kang etH.C.Fu中分离得到的新天然有机化合物,此次为首次全合成.     

2-羟基-6-甲氧基苯乙酮-4-O-β-D-葡萄糖甙的全合成研究

本文通过以间苯三酚为原料,合成了2-羟基-6-甲氧基苯乙酮-4-O-β-D-葡(?)糖甙,为验证该化合物的结构提供了依据,同时合成了11个中间体及一个副产物(3-甲基-4,6-二甲氧基-2-羟基苯乙酮),并对该副产物的反应机理进行了推测。     

7-羟基-4-甲基香豆素的绿色合成

以复合固体超强酸SO42-/ZrO2-TiO2为催化剂,在无溶剂条件下由间苯二酚和乙酰乙酸乙酯合成7-羟基-4-甲基香豆素,考察反应原料物质的量之比、反应温度、反应时间、催化剂用量等因素对收率的影响,并通过正交设计优选7-羟基-4-甲基香豆素的合成条件。试验结果表明,最佳合成条件为:n(间苯二酚)∶n(乙酰乙酸乙酯)=1∶1.5,反应温度150℃,反应时间100 min,催化剂用量0.7 g(间苯二酚0.1 mol)。在最佳合成条件下,收率达90.2%。复合固体超强酸SO42-/ZrO2-TiO2催化剂无环境污染、催化活性高、可重复利用,是合成7-羟基-4-甲基香豆素的绿色良好催化剂。     

高良姜中具有神经保护作用的化学成分研究

【目的】研究高良姜根茎的化学成分及其神经保护作用。【方法】采用正、反相色谱分离纯化高良姜化学成分,运用核磁及质谱等技术鉴定其结构;采用CCK-8法建立H₂O₂损伤SH-SY5Y细胞模型,筛选高良姜化学成分的神经保护作用。【结果】从高良姜根茎中分离得到22种化合物,分别鉴定为山柰素-4′-甲醚(1)、高良姜素(2)、山柰酚(3)、3,4′-甲氧基-3′,5,7-三羟基黄酮(4)、山柰酚-3-甲醚(5)、5,7,3′,4′-四甲氧基儿茶素(6)、二氢山柰酚(7)、柚皮素(8)、乔松素(9)、环氧松属素查尔酮(10)、(4a S, 7S)-7-hydroxy-1,4a-dimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-4,4a,5,6,7,8-hexahydronaphthalen-2(3H)-one (11)、4-异丙基-1,6-二甲基萘(12)、curcuminol D(13)、补骨脂酚(14)、(3R,4S)-4羟基蜂蜜曲霉素(15)、相对-(3R,3′S,4R,4′S)-3,3′,4,4′-四氢-6,6′-二甲氧基(3,3′-双-2H...     

17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮的分离及晶体结构

[目的]研究17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮的分离方法及晶体结构。[方法]利用液液萃取、硅胶柱色谱、重结晶等方法进行目标物的分离,并通过IR、NMR、ESI-MS、X-射线单晶衍射等手段鉴定晶体结构。[结果]晶体结构分析结果表明,该化合物为单斜晶系,空间群P2（1）/c,晶胞主要参数：a=10.881 3（16）nm,b=9.795 4（14）nm,c=13.347 3（19）nm,V=1 382.2（3）nm3,Z=4,Dc=1.414mg/m3,F（000）=616,μ=0.100/mm。[结论]从玉郎伞[Millettia Pulchra Kurz var.Laxior（Dunn）Z.Wei]的60%（体积分数）乙醇水提取物中首次分离并鉴定了17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮。     

绿色溶剂提取玉米芯黄酮的纯化及活性测定

为优化低共熔溶剂提取的玉米芯总黄酮的纯化工艺和测定纯化黄酮的活性,本文首先对几种不同特性的大孔吸附树脂进行筛选,并优化了吸附纯化工艺,然后以对羟基自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(ABTS)的清除性能为指标,评价玉米芯黄酮的抗氧化性;又通过体外抑制细菌生长实验来测定黄酮的抑菌性;最后通过体外抑制α-淀粉酶活性实验测定其降糖活性。结果表明,XAD-2树脂和D101树脂在纯化玉米芯黄酮时效果相当,浓度1 mg·mL^-1、pH 4.0的待吸附液以15 mL·h^-1的速度上样吸附,再用70 mL 70%乙醇洗脱液以60 mL·h^-1的速率对树脂进行洗脱,最终可将玉米芯黄酮分别纯化2.05和1.94倍。纯化后的玉米芯黄酮对自由基的清除能力虽弱于V_C,但较之纯化前有所增强;玉米芯黄酮对实验细菌均有抑制性,纯化后的玉米芯黄酮对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强于纯化前;玉米芯黄酮有降糖活性,较高浓度时其降糖能力接近阿卡波糖。可知低共熔溶剂提取的玉米芯黄酮有抗氧化、抑菌和降糖活性,XAD-2大孔树脂和D101大孔树脂皆可用于纯化玉米芯黄酮,纯化效果好。     

总状毛霉对17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二肟的生物转化

为了获得具有较强生物学活性或结构新颖的羟基甾体肟衍生物,利用总状毛霉对合成的17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二肟进行转化研究。转化产物经柱层析分离纯化后鉴定为7α,17α-二羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮(3)和11α,17α-二羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮(4)。目前微生物转化甾体研究领域对于甾体肟的转化研究少见报道,研究结果为甾体肟衍生物的发展奠定了基础。     

小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

目的探讨小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法采用特异性引物扩增小鼠B7-H4（mB7-H4）胞外功能区DNA,经酶切、拼接构建原核表达载体pET28a-mB7-H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21（DE3）菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果序列测定证实了构建的pET28a-mB7-H4重组表达载体含有mB7-H4编码序列,其序列分析与GenBank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量（Mr）为26.5 KD的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶12 800,Western blot分析显示抗体能特异性结合mB7-H4。结论成功制备了高表达重组mB7-H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7-H4多克隆抗体,为进一步研究B7-H4的功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。     

具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆质粒FG12后,构建了表达T7 RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7 RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7 RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7 RNA聚合酶。[结论]T7 RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。     

Development of a cELISA for effective detection of the antibody against H7 subtype of avian influenza virus

H7 avian influenza viruses(AIVs) normally circulated among birds before. From 1996 to 2012, human infections with H7 AIVs(H7 N2, H7 N3, and H7 N7) were reported in Canada, Italy, Mexico, the Netherlands, the United Kingdom and the USA. Until March 2013, human infections with H7 N9 AIVs were reported in China. Since then, H7 N9 AIVs have continued to circulate in both humans and birds. Therefore, the detection of antibodies against the H7 subtype of AIVs has become an important topic. In this stu...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达与纯化

为了解nsp7重组蛋白的免疫学活性,采用RT-PCR的方法从猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将基因连接到pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用Ni-NTA进行亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析和鉴定,通过间接ELISA方法研究了重组蛋白的免疫学活性。结果表明,成功制备了nsp7重组蛋白,间接ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,为建立nsp7特异性抗体的间接ELSIA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

基于T7 RNA聚合酶的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

    为了建立传染性法氏囊病病毒反向遗传系统,应用PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,然后分别将含有T7启动子和核酶HDV序列的A、B节段构建到载体PT-Pluc当中,构建感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3(含T7 RNA聚合酶基因,能稳定表达T7 RNA聚合酶)预先感染1 h的vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验、电镜观察和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.     

毛果杨基因PtNRT2.7的功能初步鉴定与分析

本研究从毛果杨基因组中克隆一个NRT2家族的新基因PtNRT2.7。生物信息学分析显示,其编码的蛋白不存在信号肽及切割位点,属于非分泌蛋白;具有11个跨膜结构域,亲水区与输水区交替分布,主要分布于细胞膜,而且该基因的亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞膜,综合以上结果可判断此蛋白为膜蛋白。对其在毛果杨的表达特征分析显示,PtNRT2.7基因主要在叶片中表达,其中成熟叶中的表达量最高;PtNRT2.7基因受硝酸盐诱导并在1 h时达到表达峰值;SA、JA、GA或IAA激素处理可诱导PtNRT2.7基因表达,而在Eth、ABA或NaCl处理下该基因的表达受抑制。利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥和突变体(nrt2.7),显示在KNO3浓度大于0.1 mmol/L时,PtNRT2.7过表达株系相比较拟南芥野生型和突变体株系促进了根的生长,而atnrt2.7突变体在KNO3浓度大于1 mmol/L的条件下抑制了根的生长,且PtNRT2.7过表达atnrt2.7突变体株系可恢复正常生长。研究结果表明,PtNRT2.7可以由硝酸盐和激素诱导并增强植物根系的生长,提高氮素的吸收利用。