以amdS为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立

黑曲霉是一种重要的发酵工业微生物,也是用于研究丝状真菌生长、发育、代谢、基因功能等的模式微生物。将构巢曲霉来源的乙酰胺酶编码基因amdS在黑曲霉中异源表达,成功得到黑曲霉amdS转化子。经表型分析,amdS赋予了黑曲霉在乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长的能力,而野生型菌株则生长微弱。构建了以amdS为筛选标记的基因敲除载体,以草酰乙酸水解酶基因oahA上下游同源序列构建oahA敲除质粒,转化黑曲霉后成功筛选到oahA敲除菌株,草酸合成水平明显降低。结果表明,利用amdS作为营养筛选标记能够很好地应用于黑曲霉遗传转化操作中。     

以amdS为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立

黑曲霉是一种重要的发酵工业微生物,也是用于研究丝状真菌生长、发育、代谢、基因功能等的模式微生物。将构巢曲霉来源的乙酰胺酶编码基因amdS在黑曲霉中异源表达,成功得到黑曲霉amdS转化子。经表型分析,amdS赋予了黑曲霉在乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长的能力,而野生型菌株则生长微弱。构建了以amdS为筛选标记的基因敲除载体,以草酰乙酸水解酶基因oahA上下游同源序列构建oahA敲除质粒,转化黑曲霉后成功筛选到oahA敲除菌株,草酸合成水平明显降低。结果表明,利用amdS作为营养筛选标记能够很好地应用于黑曲霉遗传转化操作中。     

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。     

基于草甘膦筛选的菘蓝转化体系的建立

介绍了以菘蓝草甘膦筛选的遗传转化体系,以携带植物表达载体pASM12的根癌农杆菌LBA4404对四倍体菘蓝进行叶盘法转化,在选择培养基中加入8 mg/L的草甘膦进行筛选,获得草甘膦抗性的再生植株,对再生植株进行PCR检测和草甘膦抗性试验,结果表明:PCR检测表明子叶的转化频率达30%,下胚轴的转化频率达40%;对PCR阳性植株的草甘膦抗性试验表明,多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性。     

农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立

选用５个水稻品种（０２４２８,武育粳２号,台北３０９,Ｍｉｌｌｉｎ和明恢６３）,通过农杆菌介导的转化方法,从前４个水稻品种中获得了来自３０９个独立抗性愈伤的的６３５棵再生植株,包括４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因植株和２１２株ＰＳＡＧ１２＿ＧＵＳ转基因植株,经组织化学检测和ＰＣＲ分析,获得的４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因樾株和２１２株ＰＳＡＧ１２－ＧＳ转基因植株,经组织化学芳觳夂停校茫曳治觯     

高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

【目的】建立PEG介导的高效银耳（Tremella fuciformis）芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1（含有构巢曲霉gpd-An 启动子和潮霉素抗性基因hph）和pLg-hph（含香菇gpd-Le启动子和hph基因）转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50 µg•ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100 µg•ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中,其转化率为110个/µg DNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因,其转化率只有9个/µg DNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在,表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化;香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子;外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。     

马铃薯高效遗传转化受体体系的建立

以4个马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种为材料,对其叶片、茎段和试管薯3种外植体再生体系进行研究,筛选与优化马铃薯遗传转化的受体材料和条件,建立马铃薯高效遗传转化受体体系。结果表明:茎段较叶片愈伤组织形成速度更快、诱导率更高。其中,‘陇薯3号’愈伤组织分化效果最佳,分化率和出苗率分别达100%和175.0%。在添加1.0mg·L~(-1)ZT+1.0mg·L~(-1) IAA+0.5mg·L~(-1)6-BA+0.2mg·L~(-1) GA的MS培养基中,4个品种的试管薯均可通过直接分化再生系统分化成苗。其中,以‘青薯168’试管薯薯片出苗率最高(110.0%)。验证了试管薯作为转化受体,受基因型的影响小,转化周期短,是马铃薯遗传转化的最佳材料,进一步建立试管薯繁育及再生体系,为马铃薯遗传转化奠定良好的基础。     

大白菜高效稳定遗传转化体系的建立

以无菌苗下胚轴为外植体,建立了大白菜高效、稳定再生和遗传转化体系,获得了转基因抗性芽。结果表明,转化效率最高的基因型为Seoul,最佳筛选培养基为MS＋2mg／L6-BA＋1mg／LNAA＋2mg／LAgN03＋300mg／L Car＋10mg／LHyg,共培养基pH5．2,完全黑暗培养,侵染液浓度OD600=0．5,侵染时间为10min,在此条件下转化效果最好。GUS染色结果表明,GUS基因已整合到抗性芽细胞的染色体中,能够稳定表达。     

盆栽小菊高效遗传转化体系的建立

采用根癌农杆菌介导的叶圆片遗传转化方法,建立了盆栽小菊稳定而高效的遗传转化体系.试验结果表明:黑暗条件下预培养2d,根癌农杆菌A600约0.5、侵染10 min,共培养3 d,延迟培养5 d能获得较高的转化率;10～15 mg/L的潮霉素具有很好的筛选效果.获得的抗性芽再生植株经PCR检测,初步证实外源基因已转入受体植物的部分株系中.     

胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立

胡萝卜是一种重要的世界性蔬菜，其丰富的营养成分、高β－胡萝卜素及鲜食特性，使之成为植物反应器的理想作物。本研究以栽培品种“新黑田五寸人参”为材料，研究了胡萝卜组织培养及遗传转化体系。得到了如下结论，愈伤诱导培养基及继代培养基为B5附加0.5mg/L2,4-D和0.5mg/L 6-BA，最适于转化的外植体为弱光下萌发的7－10天龄无菌苗之下胚轴，最适卡那霉素浓度为100mg/L，添加低浓度的乙酰丁香酮（25μM）有利转化，抗性植株再生时，除去抗生素有利于植株再生。     

蝴蝶兰高效再生体系与遗传转化体系的建立

为建立蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)再生体系和遗传转化体系,对蝴蝶兰进行人工授粉,成熟后将胚播种于诱导培养基上诱导原球茎或不定芽。探讨外源调节剂的种类及浓度,并筛选卡那霉素浓度以及除菌剂的种类及浓度。结果表明:当6-BA浓度为5 mg·L~(~(-1)),NAA浓度为1 mg·L~(-1)时,原球茎的诱导效率最高。当6-BA浓度为1.5mg·L~(-1),同时添加0.5g·L~(-1)活性炭和40mL·L~(-1)椰汁时,壮苗效果最佳。卡那霉素的筛选浓度为4mg·L~(-1),除菌剂的种类为阿莫西林克拉维酸钾(7∶1),除菌浓度为100mg·L~(-1)。     

以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法建立

为了研究籼稻有效的农杆菌介导二次遗传转化方法,以T-DNA插入突变体M1和M2幼胚为受体材料,通过G418浓度分别为100 mg/L和150 mg/L(20 d/代)的筛选培养基筛选获得的抗性胚性愈伤,转化率最高分别为10.91％和11.05％;分化生根获得M1和M2基因互补转基因水稻植株各143株和180株,经PCR检测阳性率分别达到72.0％和76.1％.试验结果表明,以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法,可以成为水稻遗传改良及基因功能研究的新方法.     

大红甜橙遗传转化高效再生体系的建立

以大红甜橙的实生苗为试材,研究6-BA与IAA的不同浓度组合和Km不同浓度对大红甜橙不同外植体离体再生的影响和IBA的不同浓度对不定芽生根的影响,建立了高效的大红甜橙遗传转化再生体系.该体系的最佳条件是:1)以实生苗上胚轴为外植体.2)以MS无机盐 100mg/L肌醇 0.2mg/LV-B1 1mg/LV-B6 1mg/L烟酸 3%蔗糖 0.8%琼脂(pH5.8) 3mg/L6-BA为不定芽诱导培养基,在26℃黑暗条件下培养7d后,转移至光/暗周期16/8h的条件下诱导不定芽的分化(40d分化率达90%).以1/2MS 3%蔗糖 0.7%琼脂 2.0mg/LIBA为不定芽的生根培养基(40d生根率达94.7%).3)筛选遗传转化转化体的Km质量浓度为50mg/L.     

二倍体栽培马铃薯高效遗传转化体系的建立

【背景】马铃薯是最重要的块茎类粮食作物。栽培马铃薯以四倍体为主,但四倍体遗传和薯块繁殖增加了马铃薯改良的难度。因此越来越多的科学家呼吁在二倍体水平进行马铃薯的再驯化,将马铃薯驯化成种子繁殖作物。自然界中存在4个二倍体马铃薯原始栽培种,这些二倍体栽培种中蕴含着丰富的遗传变异,但是它们的遗传转化体系尚未成熟。【目的】建立高效的二倍体栽培马铃薯遗传转化体系,为二倍体马铃薯优良等位基因和分子育种提供工具。【方法】以二倍体栽培种马铃薯(Solanum phureja)CIP 703541为试验材料,利用绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,对遗传转化体系进行摸索,主要包括:预处理培养时间、诱导再生的激素比例、抗生素浓度以及转化效率。另外,利用同样的激素组合对17份不同基因型的二倍体马铃薯原始栽培种进行了测试,比较各个材料在不同激素浓度条件下的再生效率,筛选出再生效率较高的激素组合进行大量遗传转化;对再生苗进行生根筛选、荧光观察和PCR鉴定,统计阳性植株的概率。用流式细胞仪检测阳性植株的倍性,以分析再生植株发生染色体加倍的频率。【结果】预处理培养时间为2 d的外植体浸染效率最高。二倍体材料CIP 703541最适合再生出芽的激素配方为2.0 mg·L~(-1)玉米素(zeatin,ZT)﹕0.01 mg·L~(-1)奈乙酸(naphthaleneacetic acid,NAA)。再生阶段抗生素卡那霉素(kanamycin,Kan)的最适筛选浓度为100 mg·L~(-1),生根阶段的最适筛选浓度为50 mg·L~(-1)。通过对不同基因型进行筛选,获得3份再生能力较强的二倍体马铃薯材料(CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541)。它们响应的激素配方各不相同,在添加了100 mg·L~(-1)卡那霉素的再生培养基中,3份材料的再生效率分别为45%、40%和52%。通过大规模遗传转化证明,3份材料的转化率分别为2.8%、4.2%和5.3%。经流式细胞仪检测,所获得的马铃薯阳性植株中四倍体的比例较高,CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541的阳性转化植株中二倍体的比例分别为5.26%、10.53%和38.46%。【结论】建立了高效的二倍体马铃薯遗传转化体系,获得了3份再生能力较强的二倍体材料。另外,发现二倍体马铃薯在经过遗传转化之后再生植株中染色体加倍的比例较高。     

黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化

建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。研究结果表明,MS6(MS+0.005 mg/L TDZ+0.20 mg/L IAA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7 d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20 min、共培养时间3 d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100 mg/L的最佳转化体系。利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。     

芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立

采用农杆菌导入法，探讨了影响芥菜农杆菌遗传转化效率的因素，优化了参数，初步建立了以MS 6-BA(2．0mg/L) NAA(0．2mg/L)为分化培养基，预培养时间3或4d，共培养时间4d，农杆菌浓度D600nm为O．5，浸菌时间10min，筛选压Kan为25mg/L的遗传转化体系。     

亚磷酸脱氢酶作为筛选标记基因在水稻遗传转化中的应用

为筛选标记基因用于植物遗传转化,采用组织培养、营养液筛选和叶面喷施等手段,综合评价了具有高催化活性的亚磷酸脱氢酶基因ptxDQ作为筛选标记基因用于水稻遗传转化的潜力.结果显示,ptxDQ基因作为筛选标记基因时,抗性愈伤的筛选效率为44.37％～47.28％,显著高于潮霉素和草胺磷等抗性基因的筛选效率.获得的转基因阳性幼...     

黄瓜子叶高效再生体系的建立与遗传转化

实验以S05、S062个黄瓜品系的子叶为外植体,以MS为基本培养基,添加不同浓度的BA、ABA、AgNO3进行再生培养。结果表明,在MS培养基上,ABA与BA组合能有效地抑制愈伤组织的形成,促进芽的发生,其再生率超过90%,每个外植体的出芽数为1～3个。S05、S06的最佳芽诱导培养基分别为:MS BA3.0mg·L-1 ABA1.0mg·L-1 AgNO32.0mg·L-1和MS BA1.5mg·L-1 ABA0.5mg·L-1 AgNO32.0mg·L-1。在此基础上,以S06子叶为受体材料,建立了pBI121-ATT1为中间载体,根癌农杆菌LBA4404介导的遗传转化体系,最终获得了3株抗性植株,经过PCR检测,初步确定均为阳性转化植株。     

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究

以水稻基因组测序品种日本晴为研究材料,对根癌农杆菌介导的水稻转化系统进行了优化。结果表明,对水稻种子采用2.5%次氯酸钠灭菌30 min的处理,愈伤组织的诱导率最高;获得的胚性愈伤组织经过6-7 d的继代培养后再转化,转化效率最高;感染时,发杆菌浓度OD600值为0.145-0.190时,转化效率较高;将抗性愈伤组织进行7 d的暗培养将大大提高分化效率。对获得的大量转化体进行初步分析,GUS表达率达到30%。     

三倍体薄皮甜瓜高效再生体系和遗传转化体系的建立

目的:建立起高效三倍体薄皮甜瓜再生体系和遗传转化体系。方法:以哈研3号薄皮甜瓜为试材,采用组织培养技术,在二倍体甜瓜再生体系的基础上,摸索外植体类型、外源调节剂种类和配比,以及各阶段的培养条件。结果:三倍体薄皮甜瓜再生最佳外植体为带有叶芽的茎段,芽诱导率为94%;芽诱导培养基最佳组合为:MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L,Agr 1.0%;芽伸长培养基最佳组合为:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,Agr 1.2%;壮苗培养基为:MS+6-BA 0.2 mg/L+GA30.1 mg/L,Agr 1.2%;生根培养基最佳组合为:1/2MS+NAA 0.5 mg/L,Agr 1.0%;培养条件为:25℃、14h光照/12h黑暗;确定卡那霉素的筛选浓度为2.5mg/L;确定头孢唑啉钠的除菌浓度为500 mg/L。结论:建立三倍体薄皮甜瓜高效再生体系和遗传转化体系,为今后的大量扩繁和转基因研究打下基础。