TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

番茄斑萎病毒研究进展

对番茄斑萎病毒（TSWV）的生物学特性、分布、寄生范围、危害症状、传播途径、检测技术研究进展进行了综述,并对今后的研究方向进行了展望.     

感染番茄斑萎病毒辣椒防御酶活性的变化

为辣椒番茄斑萎病毒病绿色防控及分子育种提供理论依据,以贵州主栽辣椒品种百宜辣椒和遵义朝天椒及易感病品种茄门甜椒作为研究材料,采用ELISA法测定感染番茄斑萎病毒（TSWV）辣椒超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶（PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化,明确辣椒对TSWV的抗性与防御酶活性的关系。结果表明：接种TSWV 第1天时,3个辣椒品种的PAL、POD、PPO和CAT活性均增高,PAL和CAT的最高峰出现在第7天,POD和PPO出现在第5天;SOD活性呈先升后降趋势,7 d后与对照的基本一致。遵义朝天椒和百宜辣椒PAL、POD、PPO和CAT活性出现2个峰值,茄门甜椒出现1个峰值,遵义朝天椒和百宜辣椒对TSWV的抗性较好,茄门甜椒的抗性稍弱。5种防御酶活性与辣椒抗TSWV密切相关,在辣椒对TSWV抗性生化机制中起重要作用。     

感染番茄斑萎病毒辣椒防御酶活性的变化

为辣椒番茄斑萎病毒病绿色防控及分子育种提供理论依据,以贵州主栽辣椒品种百宜辣椒和遵义朝天椒及易感病品种茄门甜椒作为研究材料,采用ELISA法测定感染番茄斑萎病毒(TSWV)辣椒超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化,明确辣椒对TSWV的抗性与防御酶活性的关系。结果表明:接种TSWV第1天时,3个辣椒品种的PAL、POD、PPO和CAT活性均增高,PAL和CAT的最高峰出现在第7天,POD和PPO出现在第5天;SOD活性呈先升后降趋势,7d后与对照(健康)的基本一致。遵义朝天椒和百宜辣椒PAL、POD、PPO和CAT活性出现2个峰值,茄门甜椒出现1个峰值,遵义朝天椒和百宜辣椒对TSWV的抗性较好,茄门甜椒的抗性稍弱。5种防御酶活性与辣椒抗TSWV密切相关,在辣椒对TSWV抗性生化机制中起重要作用。     

番茄斑萎病毒N基因的VIGS载体构建

目的研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV) 核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。方法以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。结果湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明：pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。结论本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

昆明番茄斑萎病毒不同分离物N基因遗传多样性分析

2009年至2011年对昆明地区番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)发生分布进行调查,并根据保守序列设计引物扩增得到21个TSWV昆明分离物S RNA 3’-末端长861nt的核苷酸序列,该序列包括N基因部分序列(710nt)。测序分析表明,所获得的21个TSWV昆明分离物N基因序列氨基酸同源性较高(97.5%～100%);构建系统进化树,昆明21个TSWV分离物与TSWV韩国分离物(TSWV-Korea)聚为1支;而在21个分离物中,鬼针草分离物与其它分离物聚为不同分支。     

番茄斑萎病毒及其传播

番茄斑萎病毒（TSWV）是广泛寄生于各种蔬菜和观赏植物的一种严重的病原。因番茄斑萎病毒引起的番茄萎蔫病在澳大利亚首次报道。番茄斑萎病毒在1965年第一次从大丽菊分离出,随后从番茄、青椒和许多其他观赏植物分离出。20世纪90年代末番茄斑萎病毒迅速在日本各地传播,成为对温室栽培的蔬菜和观赏植物侵袭最严重的病原之一。     

云南天竺葵上发现番茄斑萎病毒

[目的]在云南省昆明市植物园中发现症状表现为叶片褪绿和环斑的天竺葵,怀疑其为番茄斑萎病毒属病毒侵染。[方法]将病叶汁液摩擦接种至本氏烟,显症后取样与原样一起用3种番茄斑萎病毒属病毒的抗体采用Dot-blot ELISA方法进行检测,并用RT-PCR方法对本氏烟叶片进行检测。[结果]接种本氏烟的系统叶片在7 d后表现典型的花叶、卷曲和枯斑等症状,天竺葵病叶和接种显症的本氏烟系统叶Dot-blot ELISA和本氏烟叶片RT-PCR检测结果均表明其病原为番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)。RT-PCR产物的测序结果显示其N基因与TSWV-LE分离物核苷酸相似性达99.74%。[结论]天竺葵病样为TSWV侵染所致,这是首次在中国天竺葵上发现TSWV,对该病毒的防治工作具有参考价值。     

2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点

通过对大田栽培的烟草及周边杂草释放捕食螨——巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri),探究对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)具有最佳防治效果的捕食螨施用方法。

烟草大田期分别施用1~3次巴氏新小绥螨,每次释放间隔15 d,每种释放次数下分别设置在烟草和杂草上同时释放、仅在烟草上释放以及仅在杂草上释放3种方式。通过对比分析巴氏新小绥螨不同释放次数和不同释放方式下西花蓟马的种群数量,评价巴氏新小绥螨对烟草上西花蓟马的防控效果。

不同方式释放巴氏新小绥螨均能不同程度降低烟草大田期西花蓟马的种群数量。在烟草和杂草上同时施用3次巴氏新小绥螨对西花蓟马种群数量的控制效果最好,且维持时间最长,最高相对防效为58.02%;施用2次的防治效果次之,最高相对防效为55.57%;而仅施用1次巴氏新小绥螨对西花蓟马的防治效果最差且维持时间最短,最高相对防效仅为49.96%。相同施用次数下,仅在烟草上施用巴氏新小绥螨对西花蓟马的防治效果略高于仅在杂草上施用,但两者无显著差异。

在烟草和烟田杂草上同时释放巴氏新小绥螨能较好地控制西花蓟马,且在烟草大田期至少同时在烟草和杂草上释放2次巴氏新小绥螨(间隔期约为15 d)才能达到相对较好的防治效果。在成本允许的情况下,巴氏新小绥螨释放次数越多,对西花蓟马的防控效果越好。

     

2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点

[目的]了解云南地区番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒(Tospoviruses)与传毒蓟马的发生特点,为有效监测与防控Tospoviruses引起的斑萎病及传毒蓟马的发生流行提供理论指导和技术支撑.[方法]采用定点调查法,对云南Tospoviruses常发重灾区泸西和晋宁地区番茄、辣椒上的Tospoviruses及传毒蓟马的发生特点进行调查.[结果]2014年,泸西番茄、辣椒上斑萎病发病率和传毒蓟马种群数量均于7月7日达最高值,分别为16％、66％和1418、822头/100株.晋宁地区番茄、辣椒斑萎病发病较重,7月12日发病率达最高,分别为76％和80％,番茄上传毒蓟马种群数量在6月21日达最高峰,百株虫量为896头,辣椒在7月12日达最高峰,百株虫量为696头.经室内ELISA及分子检测,Tospoviruses种类鉴定为TSWV、TZSV;传毒蓟马种类鉴定为西花蓟马、花蓟马及棕榈蓟马,西花蓟马为绝对优势种.[结论]2014年云南泸西、晋宁等地番茄、辣椒上Tospoviruses引起的斑萎病及传毒蓟马危害严重,选择抗性品种是有效控制Tospoviruses发生流行的方法之一.针对Tospoviruses及传毒蓟马的发生特点,合理采用农业、生物、物理、化学防治等综合技术措施,才能保证蔬菜产业的健康发展.     

武威市凉州区辣椒番茄斑萎病毒病研究进展

番茄斑病毒自20世纪初被检疫发现以来,在全球范围内对多种农作物造成危害,给众多种植户造成了严重的经济损失。本文作者以武威市凉州区的辣椒种植为例,对辣椒上番茄斑萎病毒病的症状检测以及防治方法等研究现状进行了阐述。     

番茄斑萎病毒属病毒的多样性*

 番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是一类世界性分布的具有重要经济价值的植物病毒。到目前为止，该属已报道了至少28个Tospovirus病毒种或分离物，但少数分离物之间关系不清楚，甚至同种病毒的不同分离物被命名为两种不同的病毒。本文从种类、血清学、寄主范围、地理分布、传播介体以及核壳体蛋白基因（N）核甘酸序列及其推导的氨基酸序列的相似性等方面分析了所有分离物之间的关系，并通过N基因推导的氨基酸序列分析了Tospovirus病毒的遗传多样性，最后推测Tospovirus病毒起源于南亚及东南亚地区。     

番茄斑萎病毒的防治与检疫

番茄斑萎病毒为一群带有外套膜并可经由薊马传播的病毒,寄主范围相当广大且在世界各地許多重要经济作物上造成重大损失。介绍了番茄斑萎病毒的寄主范围及危害症状,概述了该病毒的检疫及防治方法。     

番茄斑萎病毒属病毒SRNA序列比对

从生物信息数据库NCBI中搜索并下载最新有关番茄萎斑病毒属Tospovirus各种间SRNA片段全长序列以及该片段上NSs、N的核酸和蛋白质序列着手,运用DNAstar和DNAMAN以及NPSA等生物信息软件对其进行比对分析,结果发现,以NSs蛋白序列建立的系统进化树显示CCSV和TZSV之间的同源性为85.8%,IYSV和TYRV之间的同源性达90%,MYSV和PSMV间的同源性为97.5%;通过N蛋白序列分析显示,Tospovirus属中有7组同源性较高的种;在Tospovirus属病毒中非极性氨基酸含量最高,极性酸性氨基酸最少,比较TSWV中抗性破坏RB株系与普通株系在NSs、N核酸、蛋白质序列、氨基酸含量和蛋白质二级结构之间的差异,发现差异不显著.     

番茄斑萎病毒在烟草植株上症状学特征

通过2006年间在美国北卡罗来那州烟草主要生产区的田间调查,系统的描述了番茄斑萎病毒侵染烤烟后,在烤烟叶片上产生的叶片畸形、镶脉、叶脉坏死、坏死斑、同心环纹、叶面皱缩,且整株出现矮化异常生长;将番茄斑萎病毒采用人工摩擦接种到本生烟上,植株被系统侵染,并产生褪绿斑坏死斑、同心环纹、皱缩等症状,植株一般4～5周内死亡.通过比较两种寄主,发现番茄斑萎病毒侵染两种寄主均出现系统症状,症状相似,但也有不同.     

番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展

番茄斑萎病毒属病毒属于布尼亚病毒科,是一类世界性分布、寄主范围很广的植物病毒,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成严重的经济损失.而高效的病毒鉴定或检测技术是防治病毒病害的关键基础之一.因此,本文就近年来番茄斑萎病毒属病毒鉴定与检测技术的研究进展作一综述,介绍生物学技术、电镜技术、血清学技术以及分子生物学技术在番茄斑萎病毒属病毒检测方法上的特点、发展应用方向等.     

番茄斑萎病毒属病毒S RNA序列比对

从生物信息数据库NCBI中搜索并下载最新有关番茄萎斑病毒属Tospovirus各种间S RNA片段全长序列以及该片段上NSs、N的核酸和蛋白质序列着手,运用DNAstar和DNAMAN以及NPSA等生物信息软件对其进行比对分析,结果发现,以NSs蛋白序列建立的系统进化树显示CCSV和TZSV之间的同源性为85.8%,IYSV和TYRV之间的同源性达90%,MYSV和PSMV间的同源性为97.5%;通过N蛋白序列分析显示,Tospovirus属中有7组同源性较高的种;在Tospovirus属病毒中非极性氨基酸含量最高,极性酸性氨基酸最少,比较TSWV中抗性破坏RB株系与普通株系在NSs、N核酸、蛋白质序列、氨基酸含量和蛋白质二级结构之间的差异,发现差异不显著.     

棉花病毒诱导基因沉默体系构建

探索了病毒诱导基因沉默载体在棉花上的应用,由烟草脆裂病毒(TRV)改造的pTV00载体,构建了棉花标记PDS基因病毒诱导基因沉默的载体,成功建立了棉花病毒诱导基因沉默体系。     

棕榈蓟马传播番茄斑萎病毒属病毒研究进展

棕榈蓟马是一种世界性的重要害虫,不仅直接取食为害作物,而且可以持久性地传播番茄斑萎病毒属病毒,对经济作物构成威胁。本文综述了棕榈蓟马传播的番茄斑萎病毒属病毒的种类、病原特征以及棕榈蓟马传毒特性等方面的研究进展。     

慢病毒介导PNX沉默细胞株的构建与鉴定

[目的]构建慢病毒介导的PNX沉默载体,感染GnRH分泌细胞(GT1-7)后进行筛选鉴定,获得稳定的PNX沉默细胞株。[方法]结合RNAi干扰技术构建出慢病毒沉默载体,在293T细胞中包装病毒并测定滴度。感染GnRH分泌细胞(GT1-7),嘌呤霉素筛选得到稳定细胞后利用Real-time PCR和Western blot检测PNX沉默效果。[结果]慢病毒介导的PNX沉默载体构建成功,包装的慢病毒成功感染GT1-7细胞,并且Real-time PCR和Western blot证实了PNX沉默细胞株的PNX沉默效果。[结论]成功构建了慢病毒介导的PNX沉默细胞株,为以后探索PNX对动物生殖发育的作用打下了基础。