体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

用聚乙烯吡咯烷酮溶解FSH制剂母牛一次注射超排效果好

FSH制剂用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解超排时,其在母牛体内的半衰期大约为3天,而溶解在盐水中一次注射超排时的半衰期用下降曲线计算仅为5小时左右。注射用盐水稀释的FSH制剂时,有一些牛的卵巢上有较多的生长卵泡不能排卵,因此,FSH溶解在盐水中注射一次不能诱发超排反应和/或卵母细胞的核成熟,而需要多次注射。     

不同剂量PMSG/HCG对小鼠超数排卵的效果

确定昆明种小白鼠超排的最佳激素剂量和分析其他影响超排的因素。将40只雌性昆明小白鼠随机分为四组。每组注射PMSG和HCG分别为5IU+5IU、5IU+10IU、10IU+5IU和10IU+10IU,注射间隔时间为48h,比较排出卵母细胞的数量。结果表明,试验3组小鼠排出卵母细胞的平均数量(57.1枚),显著(P<0.05)高于试验1组(42.7枚)和试验2组(41.7枚),极显著(P<0.01)高于试验4组(30.7枚)。其它三组间无显著差异。左右卵巢的排卵数也未表现出明显差异。初步说明昆明小白鼠超排的最佳激素剂量为10IU PMSG+5IU HCG,但要想得到很好的超排效果还要考虑其他因素。     

不同剂量PMSG/HCG对小鼠超数排卵的效果

确定昆明种小白鼠超排的最佳激素剂量和分析其他影响超排的因素。将40只雌性昆明小白鼠随机分为四组。每组注射PMSG和HCG分别为5IU＋5IU、5IU＋10IU、10IU＋5IU和10IU＋10IU,注射间隔时间为48h,比较排出卵母细胞的数量。结果表明,试验3组小鼠排出卵母细胞的平均数量（57．1枚）,显著（P〈0．05）高于试验1组（42．7枚）和试验2组（41．7枚）,极显著（P〈0．01）高于试验4组（30．7枚）。其它三组间无显著差异。左右卵巢的排卵数也未表现出明显差异。初步说明昆明小白鼠超排的最佳激素剂量为10IU PMSG＋5IU HCG,但要想得到很好的超排效果还要考虑其他因素。     

超排兔卵巢卵母细胞直接用于体细胞核移植的研究

为了评估兔超排后卵巢残留卵泡内卵母细胞用作体细胞核移植的潜力,应用PMSG或FSH诱导母兔超排,排卵结束(hCG注射14h)后,抽吸卵巢表面卵泡回收卵母细胞(抽吸组/处理组)用于体细胞核移植(SCNT),同时与自然排卵到输卵管内的卵母细胞(排出组/对照组)进行比较。结果表明,PMSG和FSH超排获得的抽吸组成熟卵母细胞(以可见第一极体为准)的比率分别极显著和显著低于各自的排出组(PMSG:70.7%vs94.6%,P0.01;FSH:81.5%vs94.6%,P0.05),且PMSG和FSH抽吸组间卵母细胞的成熟率差异显著(70.7%vs 81.5%,P0.05)。PMSG和hCG超排的抽吸组成熟卵母细胞的去核效率也显著低于各自的排出组(PMSG:抽吸vs排出=69.2%vs83.6%,P0.05;FSH:抽吸vs排出=71.6%vs81.0%,P0.05)。抽吸组成熟的卵母细胞注核效率以及此类卵母细胞用作胞质受体经体细胞移植后的重构胚在融合率、分裂率以及分裂胚胎发育至囊胚的比例与排出组差异均不显著(P0.05)。另外,抽吸组卵母细胞孤雌激活后胚胎的发育能力以及囊胚细胞总数与排出组差异也不显著(P0.05)。但是,PMSG超排后的抽吸组成熟卵母细胞体细胞核移植的总体效率显著低于相应的排出组(8.4%vs11.5%,P0.05),而FSH超排的卵母细胞抽吸组与排出组差异则不显著(10.2%vs11.6%,P0.05)。结果显示,抽吸自超排兔卵巢表面卵泡内的卵母细胞大多数都已经成熟,虽然去核效果要差些,但获得的重构胚与源自排出到输卵管内的卵母细胞的重构胚具有等同的发育能力,可以不经体外成熟培养而直接用于体细胞核移植,而且FSH超排获得的抽吸组卵母细胞体细胞核移植的总体效率与自然排卵到输卵管内的卵母细胞没有显著差别。     

母羔自身因素与其超排卵母细胞数量的相关性分析

为讨论羔羊自身因素与其超排后卵母细胞数量的关系,选取6～8周龄的健康杜晋绵羊（杜泊羊（o）×晋中绵羊♀）母羔31只,进行超数排卵,手术法收集卵母细胞,统计其卵母细胞数量,分析其与全同胞羔羊数、初生重、超排时体重的相关性.结果表明：全同胞羔羊数与卵母细胞数量呈极显著负相关（P＜0.01）,初生重与卵母细胞数量呈极显著正相关（P＜0.01）;超排时体重与卵母细胞数量相关不显著（P＞0.05）.全同胞羔羊数和初生重是羔羊超排卵母细胞数量的影响因素,但仍需进一步增加羔羊数量来验证.     

高寒放牧条件下牦牛超排试验

在高寒放牧条件下,对12头祁连山型母牦牛进行了选择不同超排方法和FSH剂量及使用中科院动物所FSH、LH,国产PGP2α、HCG,新西兰FSH的超排试验,供试母牦牛在发情11～12天开始注射FSH.结果表明A组FSH 8.4 mg,母牦牛与正常发育相似,冲出2枚发育正常囊胚,1头放弃;B组FSH 8.6 mg,利用PVP包埋1次注射,母牦牛卵巢处于静止状况,插管1头,没有冲出胚胎,超排处理无结果.说明牦牛用FSH 8.4～8.6mg剂量偏小,对超排无效果;C组FSH8.8 mg,分FSH+LH(2001U)、FSH+HCG(10001U)、卵巢黄体数10±4,2头牦牛冲卵,获14枚胚胎,有1头牦牛冲出10枚胚胎,其中有2枚发育到16细胞,1枚发育到32细胞,说明FSH+HCG(LH)有协同作用,促进卵巢上卵母细胞成熟和排卵;D组FSH 15 mg(新西兰产)1头牦牛冲出3枚发育正常早期囊胚.     

绒山羊羔羊超数排卵的影响因素研究

本研究以羔羊为研究对象,利用外源激素刺激其卵巢发育,收集卵母细胞,筛选后进行成熟培养,研究获得的卵母细胞和成熟后的数量和质量。分别探讨了不同周龄、不同激素来源和使用剂量、重复超排和季节对辽宁绒山羊超数排卵的影响。结果表明,5～6周龄为辽宁绒山羊羔羊的适宜超排时期;国产FSH+PMSG组超排反应最好,加拿大产FSH+PMSG组均获得体外成熟的卵母细胞数量最多;春季是适于进行卵母细胞采集的季节,而夏季不适合进行卵母细胞采集;重复超排获卵数较初次超排极显著降低,但体外成熟率优于首次超排。     

哺乳动物卵母细胞非整倍体产生机制的研究进展

雌性生殖细胞进行减数分裂时易发生染色体分离错误而产生非整倍体卵母细胞,其受精后会产生非整倍体胚胎,导致出生缺陷或胚胎致死,是影响哺乳动物繁殖的重要因素。卵母细胞在第一次减数分裂前期发生同源染色体联会,此时DNA双链断裂引发重组。重组时缺乏交叉、重组事件数量的减少及交叉靠近端粒或着丝粒导致染色体发生同向分离或不分离,从而产生非整倍体卵母细胞。减数分裂期间,当染色体的端粒共向于同一极或没有完全附着在纺锤体微管上时,纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint,SAC）被激活,E3泛素连接酶APC/Cyclome （APC/C）沉默,保护分离酶抑制蛋白（securin）和细胞周期蛋白B （cyclin B）不被降解,从而抑制分离酶和染色体的分离。直到所有染色体与纺锤体实现稳定的双极定向并正确排列到赤道板上,SAC关闭,染色体正确分离。卵母细胞中SAC蛋白缺失,导致SAC不能有效地监测端粒在纺锤体上的正确附着,发生染色体分离错误,从而产生非整倍体卵母细胞。因此,通过现代分子技术手段解析非整倍体卵母细胞所涉及的机制是保护哺乳动物生育的重要目标。作者主要介绍了卵母细胞减数分裂的特点,详细阐述了卵母细胞非整倍体发生的染色体分离错误的分子机制,以期为开发卵母细胞非整倍体的治疗手段提供参考。     

重复超数排卵获取家兔成熟卵母细胞的研究

采用重复手术方法 ,对经过激素刺激超数排卵的家兔成熟卵母细胞进行收集和筛选评价 ,探索不同组合激素处理对家兔进行超数排卵 ,获得大量的高质量卵母细胞简单有效的方法 ,为进行兔转基因、核移植等相关方面的研究奠定基础。采用FSH +HCG和FSH混合PVP(2 5 % )两种激素处理组合 ,并用正常排卵雌兔作对照 ,经过三次手术法取卵 (每次间隔至少 5 0d以上 )。经输卵管插管 ,由输卵管伞端收集卵母细胞并进行筛选。结果 ,采用激素处理的两组获取总卵母细胞数和可用卵数比对照组均高出 3倍以上 (P <0 0 5 ) ,两种超排方法之间超排效果无显著差异 (P >0 1) ;三次连续手术均成活的家兔中 ,对照组和FSH +HCG组三次取卵效果无显著差异 (P >0 0 5 ) ,FSH混合PVP(2 5 % )组首次手术与第三次手术出现显著差异 (P <0 0 1)。重复采用FSH +HCG和FSH混合PVP(2 5 % )两种激素处理组合超数排卵 ,手术法收集卵母细胞 ,简化超排程序 ,增加超排效果 ,提高实验动物利用率     

对C57BL／6小鼠超排效果的研究

本文以近交系C57BL／6小鼠为实验对象．研究注射不同剂量的PMSG和hCG对小鼠超排效果的影响。取C57BL／6小鼠各30只,按照注射剂量不同分为A、B、C三组,每组10只,A组注射PMSG2．5IU,HCG2．5IU,B组注射PMSG5．0IU,HCG5．0IU,C组注射PMSG7．5IU,HCG7．5IU。每只小鼠腹腔注射PMSG,间隔48h后分别注射HCG进行超数排卵,再与性成熟同系公鼠合笼,次日早上检查阴道栓．有栓雌鼠用颈椎脱臼法处死。在实体显微镜下由输卵管膨大部冲卵．收集卵母细胞置于盛有M2培养液的表面皿中检查计数．分析超排效果。结果表明。C57BU6小鼠B组的平均取卵数极显著高于A组的平均取卵数（P〈0．05）;B组的平均取卵数显著高于C组的平均取卵数（P〈0．05）;C组与A组的平均取卵数差异不显著（P〉0．05）。     

高寒放牧条件下牦牛超排试验

在高寒放牧条件下 ,对 12头祁连山型母牦牛进行了选择不同超排方法和FSH剂量及使用中科院动物所FSH、LH ,国产PGF2α、HCG ,新西兰FSH的超排试验 ,供试母牦牛在发情 11～ 12天开始注射FSH。结果表明 :A组 :FSH 8 4mg ,母牦牛与正常发育相似 ,冲出 2枚发育正常囊胚 ,1头放弃 ;B组 :FSH 8 6mg ,利用PVP包埋 1次注射 ,母牦牛卵巢处于静止状况 ,插管 1头 ,没有冲出胚胎 ,超排处理无结果。说明牦牛用FSH 8 4～ 8 6mg剂量偏小 ,对超排无效果 ;C组 :FSH 8 8mg ,分FSH +LH( 2 0 0IU)、FSH +HCG( 10 0 0IU)、卵巢黄体数 10± 4,2头牦牛冲卵 ,获 14枚胚胎 ,有 1头牦牛冲出 10枚胚胎 ,其中有 2枚发育到 16细胞 ,1枚发育到 3 2细胞 ,说明FSH +HCG(LH)有协同作用 ,促进卵巢上卵母细胞成熟和排卵 ;D组 :FSH 15mg(新西兰产 ) 1头牦牛冲出 3枚发育正常早期囊胚。     

兔卵母细胞去核方法的研究

本研究观察了兔卵母细胞的纺锤体在不同条件下的变化，并对不同去核方法的去核效率进行了比较。结果表明，在卵母细胞去核时应用piezo-driven操作系统，能有效减少去核对卵母细胞的机械挤压损伤，使卵母细胞去核后存活率达98％。卵母细胞中极体与核的相对距离随着卵龄的增加而加大，卵龄16h的卵母细胞只有70.4％的核位于极体附近，当卵龄增加到19h时，这一比例下降到60.5％。用spindle view系统能有效提高去核效率，使去核率从盲吸法的83.8％提高到98.4％，且发现在注射hCG后19h左右去核较为合适。纺锤体对环境变化敏感，适宜的温度为36～37℃，温度不适容易使纺锤体解聚。     

不同超排方案以及重复超排对犊牛超排效果的影响

本试验选择北京奶牛中心良种场36头9~12月龄的犊牛进行超排采卵,研究了不同超排方案以及重复超排对犊牛超排的效果。结果表明,超排方案以埋植CIDR的同时,第5天、第6天注射FSH,第7天手术采卵获得的可用卵母细胞数最多。两次重复超排对犊牛平均卵泡数和平均卵母细胞数没有显著影响,但三次超排后的平均卵泡数和平均卵母细胞数显著低于一次和二次超排。     

PMSG不同剂量对小白鼠超排效果的影响分析

目的:确定不同剂量PMSG对小白鼠的实际超排效果所产生的影响,在实验的过程中配合HCG共同进行实验。方法选取40只小白鼠,将其平均分为四个小组。每一组PMSG与HCG注射剂量大约5IU+5IU,5IU+10IU,10IU+5IU,10IU+10IU,其中注射的时间要注意间隔48小时左右,对排出卵母的细胞数量进行客观比较。结果试验三组小鼠排出卵母的细胞平均数大约是57.1枚,与试验1组以及试验2组相比要明显的较高,其他的三组则并不存在显著的差异。同时,左右排卵的实际排卵数也不存在显著差异。结论这也表明这些小白鼠的超排最佳激素剂量大约是10IU PMSG+5IU HCG。但是如果想要获得更加优良的超排效果,还要注意相对全面的考虑其他方面的因素。     

AuroraA激酶在猪卵母细胞成熟分裂过程中的动态分布及其与微管蛋白相关性分析

为探讨Aurora A激酶在猪卵母细胞成熟过程中的动态分布及其与细胞微管蛋白相关性,采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术,检测Aurora A蛋白的动态分布与亚细胞定位,然后分别使用Aurora A特异性抑制剂(MLN-8054)、微管蛋白抑制剂(秋水仙素)处理猪卵母细胞,研究Aurora A与细胞骨架分布的相关性。结果显示:在生发泡(GV)期,Aurora A主要分布在细胞质中,在第一次和第二次减数分裂中期,即MⅠ和MⅡ期,Aurora A则主要伴随着纺锤体分布,与纺锤体有着相似的亚细胞定位;使用Aurora A特异性抑制剂MLN-8054处理细胞后,与对照组相比,纺锤体形态异常的比例显著增加;使用秋水仙素处理细胞后,α-微管蛋白结构紊乱地分布在染色体周围或消失,而Aurora A蛋白或以异常形态伴随纺锤体分布,或消失。结果表明:猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora A与纺缍体微管的分布密切相关,并具有明显的阶段性特点,Aurora A可能通过参与调节纺锤体微管的组装进而参与猪卵母细胞减数分裂的调控。     

羔羊不同超排方法的筛选及其对卵母细胞体外成熟的影响

旨在比较不同超排方案对羔羊超数效果及其对卵母细胞体外成熟的效果，筛选最佳幼畜超排方案。试验以1～2月龄绵羔羊为研究对象，分为3组，其中2组(方案I和方案II注射激素)为试验超排组，1组为对照组(未注射激素),探究不同超排方法对绵羔羊卵巢的反应性、卵巢的大小及卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，6次×12 h间隔、注射总剂量180 U促卵泡素(FSH)的超排方案Ⅱ效果优于4次×12 h间隔、注射总剂量200 U FSH的超排方案Ⅰ,超排方案Ⅱ获得发育卵泡数(348.00±8.25)枚/只优于超排方案Ⅰ发育卵泡数(265.00±6.32)枚/只；体外培养卵母细胞24 h后，超排方案Ⅱ卵母细胞成熟率45.4%优于超排方案Ⅰ卵母细胞成熟率32.2%。研究筛选出6次×12 h间隔、注射总剂量180 U FSH,第1次注射FSH时同时肌内注射330 U PMSG的超排方案为最佳幼畜超排方案。本试验结果为绵羔羊扩展体外受精所需卵子的来源，缩短世代间隔，产生大量优秀后代，加速育种进程等方向的研究奠定一定的理论基础。     

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。     

不同供核细胞处理方法及激活时间对猪核移植重构胚发育的影响

利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞经过去核、注核及激活等操作后,研究猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞,血清饥饿处理法及不同的激活时间等因素对猪核移植重构胚体外发育的影响。结果表明,猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞用作核供体与猪卵母细胞构建重构胚,在卵裂率上无显著性差异。作为供核细胞的猪成纤维细胞,经过血清饥饿与不经过血清饥饿培养,核移植重构胚的卵裂率无显著性差异(P>0.05)。在进行核注射后,使供核细胞与胞质受体作用适当的时间(1～6h)再进行激活,有利于重构胚的发育。     

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。