黄秋葵再生体系的建立及毛状根的诱导

[目的]建立黄秋葵的再生体系并诱导其毛状根.[方法]以黄秋葵无菌苗的叶片和茎段为外植体,建立黄秋葵的体细胞再生体系,并利用发根农杆菌A4侵染黄秋葵叶片,诱导毛状根.[结果]愈伤组织的最佳诱导培养基为MS＋ 1.0 mg/L 6-BA ＋0.5 mg/L NAA时;最佳体细胞胚发生培养基为MS ＋0.5 mg/L NAA;毛状根最佳诱导条件为叶片预培养48h,侵染时间6min.[结论]该研究为成功构建黄秋葵遗传转化体系和研究黄秋葵中的次生代谢产物奠定了基础.     

桑树毛状根再生条件研究

为建立桑树毛状根的再生体系,以桑树毛状根作为外植体,研究不同质量浓度6-BA和NAA配比对桑树毛状根愈伤组织诱导和不定芽分化的影响,并对再生植株进行PCR检测。结果表明,桑树毛状根的最佳愈伤组织诱导培养基为MS+0.2mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA,最佳不定芽分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA,3周愈伤组织不定芽分化率为16.7%。应用该不定芽获得再生植株的根系生长旺盛,叶片提取的基因组中含有rolB生根基因。     

乌拉尔甘草毛状根的诱导及培养体系的建立

采用针刺幼茎法和外植体共培养法,以发根农杆菌ATCC15834和A4侵染乌拉尔甘草子叶、下胚轴和活体幼苗,诱导毛状根生成,建立毛状根诱导及培养技术体系。试验结果表明,OD₆₀₀为0.5～0.6的ATCC15834菌液（含乙酰丁香酮100 μmol/L）经针刺幼茎法侵染株龄14 d的乌拉尔甘草活体幼苗后,在含500 mg/L头孢霉素的1/2MS培养基上毛状根诱导率达79.2%。毛状根在不含激素及蔗糖质量浓度为40.0 g/L的1/2MS液体培养基中生长迅速,25 d毛状根增殖率达到19.3倍。     

农杆菌Ri诱导丹参毛状根培养体系的优化

采用发根农杆菌R1601菌株浸染丹参叶片、茎段、叶柄、带节茎段等外植体.结果表明,相比茎和叶柄,丹参叶片更适宜诱导毛状根;带节茎段经发根农杆菌R1601侵染后,幼苗根系较为发达,粗壮.而由其他3种丹参外植体诱导产生的毛状根生长相对较慢,形成的根较细而弱.     

冬凌草毛状根体系的建立

用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草无菌幼苗的叶片、茎段进行侵染,而后通过共培养的方法诱导其产生冬凌草毛状根,从而建立有效的冬凌草毛状根培养体系。通过PCR进一步检测T-DNA是否成功导入冬凌草毛状根中。通过用发根农杆菌ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草外植体进行侵染,能够成功诱导产生冬凌草毛状根,从而对冬凌草毛状根培养体系进行建立,在一定程度上为冬凌草毛状根的大规模培养奠定基础。     

黄秋葵子叶离体再生体系的建立

以带子叶和部分下胚轴的顶芽为外植体,建立再生体系。结果表明,下胚轴长度为2 mm时有利于不定芽的形 成,7-10 d苗龄的外植体最易诱导出不定芽,芽分化和生长的最适温度为25±1℃。6-BA<1 mg／L不定芽难以发 生,6-BA 6+NAA 0.1有利于不定芽形成;CA3 2.0可以提高不定芽的诱导率。     

黄秋葵子叶离体再生体系的建立

以带子叶和部分下胚轴的顶芽为外植体,建立再生体系.结果表明,下胚轴长度为2mm时有利于不定芽的形成,7～10 d苗龄的外植体最易诱导出不定芽,芽分化和生长的最适温度为25±1℃.6-BA＜1 mg/L不定芽难以发生,6-BA 6+NAA 0.1有利于不定芽形成;GA3 2.0可以提高不定芽的诱导率.     

罗勒毛状根的诱导及培养

[目的]利用4种发根农杆菌R1,R1601,1025,1000诱导药用植物罗勒产生毛状根,建立毛状根培养体系。[方法]利用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。[结果]利用发根农杆菌1025,预培养2d的叶片为转化材料,感染6～8min,加入0.1mg/LNAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察,确立罗勒毛状根在1/2MS培养基中的最佳继代时间为21d。[结论]罗勒毛状根离体培养的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立

选取中国大豆品种中黄13、黑豆44和黑豆51的子叶为外植体材料,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599菌株诱导3个大豆品种产生毛状根,通过β-葡聚糖苷酶(GUS)染色进行转化效率检测。结果表明:在25℃、12h/d黑暗培养条件下,黑豆44上诱导的毛状根数量最多,显著多于中黄13和黑豆51;黑豆44诱导的毛状根转化率最高,显著高于中黄13,但与黑豆51没有显著差异;光照或黑暗培养对中黄13产生毛状根的效率没有显著影响,但黑豆44和黑豆51在黑暗培养条件下子叶产生的毛状根数明显高于光照培养条件下产生的毛状根数;大豆孢囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)能侵染3个大豆品种的毛状根,其中对黑豆51的侵染效率显著高于黑豆44和中黄13,侵染位点主要位于根系的生长点。     

茶树毛状根的诱导

利用几种不同发根农杆菌株系感染茶树外植体，得到茶树毛状根。通过筛选，找出对其诱导效率最高的一个株系是15834，并证实了乙酰丁香酮对诱导具有促进作用。     

苦荞麦毛状根的诱导研究

利用发根农杆菌Ri1601浸染苦荞植物预培养2d的叶片外植体,经不同时间的共培养和除菌培养后获得毛状根。经硅胶薄层色谱板检测表明,发根农杆菌Ri1601和苦荞叶片上未经转化产生的不定根都不含有冠瘿碱;而经发根农杆菌Ri1601遗传转化后所产生的毛状根有冠瘿碱的存在。因此,可确定苦荞叶片上产生的毛状根为发根农杆菌Ri1601转化所得。建立了用发根农杆菌Ri1601诱导苦荞植物叶片产生毛状根的有效方法。     

老瓜头离体根与毛状根的诱导培养

以老瓜头茎段为外植体筛选诱导离体根再生的最适培养基,以老瓜头茎段和叶片为外植体筛选发根农杆菌介导的毛状根诱导产生的最适条件,为老瓜头毛状根的大量培养及有效成分利用提供前期的试验参考.结果表明,添加NAA的MS培养基诱导老瓜头离体根再生的效果明显,带腋芽茎段的生根率可达到100%,不带腋芽的茎段生根率为67.5%;含有IBA的培养基上,带腋芽的茎段生根率低,只有3.9%,不带腋芽的茎段无根生出.以发根农杆菌A4菌株介导的老瓜头毛状根诱导过程中,用D600 nm=0.8的菌液侵染叶片15 min,诱导率及诱导密度最高,分别为100%和4.6;用D600 nm=0.8的菌液侵染茎段(不带腋芽)15 min时,诱导率最高达46.7%.老瓜头茎段在添加NAA的MS培养基上容易生根;最适转化条件为发根农杆菌A4菌液浓度D600 nm=0.8,侵染15 min,800 mg/L头孢噻肟钠除菌;叶片是遗传转化最适外植体.     

山豆根毛状根培养体系的建立与优化

为探索定向培养山豆根植物细胞及器官获取有效药用成分的新途径,为山豆根有效药用成分的大规模生产奠定基础,采用共培养法研究发根农杆菌R1601感染诱导山豆根无菌苗子叶产生毛状根,并在此基础上从不同培养液、不同蔗糖浓度和外源激素对毛状根生长的影响方面筛选山豆根毛状根生长的最佳培养液。结果表明:利用发根农杆菌R1601感染山豆根无菌苗子叶16min,在MS+AS 100μmol/L的固体培养基上培养可诱导产生毛状根,且诱导率最高,达66.67%;1/2 MS+IAA 0.5mg/L+5%蔗糖的培养液最有利于山豆根毛状根的生长。     

地黄毛状根的诱导及条件优化

以发根农杆菌Accc10060菌株侵染地黄外植体,研究不同菌液浓度、不同侵染时间和不同共培养时间对地黄毛状根诱导率的影响。结果表明,发根农杆菌Accc10060菌株可成功诱导出地黄毛状根,PCR检测发现发根农杆菌Ri质粒rol C基因已整合到地黄基因组中并得到表达;单因素试验结果显示,在地黄毛状根的诱导过程中,诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.6,最佳侵染时间为10 min,最佳共培养时间为4 d。     

党参毛状根诱导条件研究

[目的]研究党参毛状根的诱导条件。[方法]利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导,探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。[结果]3种发根农杆菌中A4诱导率最高;茎段的诱导率最高;发根农杆菌浓度在OD_(600)为0.4时诱导效果较好;较佳侵染时间为5 min;共培养时间为2 d时诱导率较高;头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时除菌效果较好。[结论]该试验为大量生产毛状根以及毛状根的后续研究提供试验基础。     

发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究

[目的]为苦参有用成分的大量生产提供新的途径。[方法]利用发根农杆菌R1601分别对药用植物苦参的根段、茎段、叶片、子叶进行侵染。[结果]在相同条件下,叶片、茎段和根段成功诱导出毛状根,但诱导频率不同,茎段作为外植体诱导率最高,达到26.7%,更适合作为外植体选用。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。[结论]发根农杆菌的RiT-DNA基因已经整合到苦参基因组中。该研究为采用生物技术生产苦参活性成分奠定了基础。     

发根农杆菌诱导栝楼毛状根的研究

栝楼是一种重要的药用植物,提取物具有多种活性。以栝楼的无菌苗为材料,用A4、15834和LBA9402等3种发根农杆菌浸染茎段,诱导毛状根生成,并研究毛状根分化不定芽的条件。结果显示,3种农杆菌都能诱导栝楼毛状根产生,其中LBA9402诱导率最高,达到52%,且毛状根在6-BA 2.0 mg.L-1 KT 2.0 mg.L-1 NAA 0.5 mg.L-1的培养基上,不定芽分化率达到了24%。对毛状根进行基因组DNA提取,PCR扩增检测出rolB基因的存在,初步证明R i质粒T-DNA已经整合到栝楼基因组中。     

南药巴戟天毛状根诱导条件优化研究

为探索巴戟天毛状根的诱导条件,该研究选择不同发根农杆菌ATCC15834、AR10、Msu440菌株诱导巴戟天无菌苗的幼芽、叶片、叶柄、茎段等外植体形成毛状根,并研究了共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对巴戟天毛状根转化率的影响。结果表明:巴戟天毛状根的最佳诱导条件为:以幼芽为外植体,ATCC15834为转化菌,侵染时间20 min,并在培养基中添加300μmol/L乙酰丁香酮条件下,巴戟天毛状根的诱导转化率最高,可达36.7%。     

龙葵毛状根诱导及其抑菌活性的研究

[目的]探讨龙葵毛状根作为新的抑菌剂的可能性,为其开发利用提供理论依据。[方法]以龙葵叶片为试验材料,利用发根农杆菌的遗传转化技术,对龙葵叶片进行毛状根的诱导。并采用纸片法用龙葵毛状根水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌进行抑菌活性试验。[结果]龙葵叶片经农杆菌A4侵染后7 d产生毛状根,毛状根具有多分枝、生长迅速且无向地性等特点,PCR及高压纸电泳检测结果表明Ri质粒的t DNA已整合进毛状根中。相同质量浓度下的龙葵毛状根水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用较强,龙葵毛状根水提物的抑菌效果优于龙葵实生根并具有显著性差异。[结论]龙葵毛状根对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和芽孢杆菌均有一定程度的抑制作用,其药用价值有待进一步研究。