草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

草鱼PepT2基因的克隆及其表达分析

采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长c DNA序列,对其进行生物信息学和共线性分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp,包括开放阅读框2169bp(编码722个氨基酸残基),5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp;草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子;预测蛋白相对分子质量为8.032×10⁴,等电点为6.01,该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构,并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环,跨膜区氨基酸高度保守,含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点;预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠;氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为86.65%,与其他所比较的物种的同源性则为52.83%～68.15%;系统进化树分析...     

鳡胰岛素样生长因子1基因的克隆及其组织特异性表达分析

为克隆鳡(Elopichthys bambusa)的胰岛素样生长因子1(IGF1)全长cDNA和启动子序列及明确其组织表达特征,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)和染色体步移等技术,从鳡肌肉中获得了IGF1基因的全长cDNA(844bp)和上游启动子部分序列(627bp)。结果表明:IGF1基因包含218bp的5′端非翻译区、140bp的3′端非翻译区和486bp的开放性阅读框(ORF),编码161个氨基酸,包含前44个氨基酸残基为信号肽、70个氨基酸残基的4个功能结构域和C端47个氨基酸残基的延伸肽结构域。启动子无TATA框,但含有一成肌分化抗原(Myo D)结合位点。氨基酸同源性和系统发育分析发现,鳡IGF1与鲤形目其他鱼类的同源性较高(94.41%～99.38%),亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,IGF1在鳡的肝脏中表达最高,而心脏中未见其明显表达。该研究为明确IGF1参与鳡生长发育的机制研究及其在鳡的繁殖育种中的应用奠定了基础。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达.[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达.[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸.预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62.HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE).系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支.卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低.哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著.[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据.     

草鱼肠道组织抑制性消减表达序列标签的初步分析

以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因.     

鹅催乳素受体基因cDNA 2种新5′-UTR特征分析

应用5′-RACE技术,在成年雄鹅睾丸中克隆到长度分别为361 bp、499 bp和594 bp 3种催乳素受体基因(gPRLR)cDNA 5′-端片段,表明雄鹅睾丸至少表达3种gPRLR mRNA.3种5′-端序列含有长度分别为210 bp、348 bp及443 bp的不同5′-UTR.3种5′-端序列后195个核苷酸一致,与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA第3和第4a外显子高度同源.3种5′-端序列起始密码子ATG均位于第3外显子45～47 bp处,与cPRLR cDNA起始密码子同一位置.348 bp与443 bp 5′-UTR结构相似.348 bp 5′-UTR中,第3外显子上游依次是235 bp和69 bp,其中69 bp与cPRLR cDNA第2外显子高度同源.443 bp 5′-UTR比348 bp 5′-UTR多插在235 bp和69 bp之间的95 bp.这些结果表明,含348 bp和443 bp 5′-UTR的mRNA来源于同一初级转录本转录后的选择性剪接.与348 bp和443 bp 5′-UTR不同的是210 bp 5′-UTR在第3外显子的上游含有一个不同的166 bp序列.这表明含210 bp 5′-UTR的mRNA来源于另一初级转录本348 bp 5′-UTR或443 bp 5′-UTR mRNA.     

Isolation,Identification and Tissue Expression Profile Analysis of One Novel Differentially Expressed Sequence Tag in the Longissimus dorsi Muscle from Meishan,Meishan × Large White Hybrid and Large White Pigs

In order to detect the molecular mechanism of heterosis in pigs, the mRNA differential display technique was performed to investigate the differences of gene expression in the Longissimus dorsi tissue from Meishan, Meishan × Large White hybrid and Large White pigs with nine 3'-end anchored primers in combination with ten 5'-end arbitrary primers and nearly 3 000 reproducible bands were examined. One novel expressed sequence tag (EST4,GenBank accession number: AY553914) that was differentially expressed in Meishan,Meishan × Large White hybrid and Large White pigs was isolated from the Longissimus dorsi muscle tissue and identified through semi-quantitative RT-PCR. BLAST analysis revealed that the 350 bp long EST (EST4) was not homologous to any of the known porcine genes.Tissue expression profile analyses showed that the EST4 was expressed in most of tissues.     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析

 用RACE技术从受精后约22 h的草鱼胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD基因的全序列,并对其序列进行了分析。结果表明，草鱼MyoD基因全长cDNA为1 597 bp,其中开放阅读框为825 bp，共编码275个氨基酸，结构分析表明该肽链第1～84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域，该序列所编码的肽链没有信号肽；通过对比分析已知的GeneBank中其它脊椎动物MyoD基因发现，该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致；草鱼MyoD基因的克隆为研究家鱼的肌肉发育调控的机理以及肉质改良奠定了基础。     

草鱼JAK2基因片段序列的克隆及其组织表达分析

通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法从草鱼肝脏中首次克隆获得草鱼JAK2基因的片段序列。该片段序列长671 bp,编码223个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼JAK2基因片段与其他物种的相似性在70%～91%之间;系统进化树显示,鱼类的JAK2独立聚成一支,草鱼与斑马鱼聚成一支,与鳜鱼和墨绿凹鼻鲀聚成的一支再聚成一支。实时荧光定量PCR分析表明,草鱼JAK2基因在肝脏、肌肉、脑、心脏、脾脏和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在肝脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),其次是肌肉、脑、脾脏和肠系膜脂肪组织,在心脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P<0.05)。本研究为进一步研究草鱼JAK2基因的结构和功能奠定了基础。研究亮点:JAK2基因在鱼类上的研究报道甚少。本研究首次克隆了草鱼JAK2基因片段序列;且发现JAK2基因在肝脏组织中表达量最高,心脏组织中表达量最低,为草鱼JAK2基因的结构及其信号转导等生理功能的深入研究奠定了基础。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

LR 型微囊藻毒素对鲢鱼PEPCK基因表达的影响

在前期经LR型微囊藻毒素(MC-LR)处理后建立鲢鱼肝脏组织抑制差减杂交文库的基础上,利用RACE方法克隆了经MC-LR处理后差异表达明显的鲢鱼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因cDNA全长,并对其进行了序列分析,然后通过半定量分析了经MC-LR投与1、5、10 h鲢鱼肝脏组织PEPCK表达水平.结果显示:鲢鱼PEPCK基因cDNA全长2 605 bp,包括101 bp的5 '端非翻译区、564 bp的3 '端非翻译区、1 911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸.将鲢鱼PEPCK基因cDNA核酸及氨基酸序列与GenBank中已发表的其他几种鱼类的相应序列进行比对,表明鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97％和99％;其次为斑马鱼,同源性均达到90％以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77％和84％,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性.鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序.另外,鲢鱼投予MC-LR后,肝脏组织PEPCK经过1、5、10 h的表达量均有显著升高,说明鲢鱼投予MC-LR 1 h内该基因即被诱导表达,且在10 h内皆维持较高的表达水平.这与微囊藻毒素作用有关,推测与微囊藻毒素解毒过程相关.     

LR 型微囊藻毒素对鲢鱼PEPCK基因表达的影响

在前期经LR 型微囊藻毒素（MC-LR）处理后建立鲢鱼肝脏组织抑制差减杂交文库的基础上,利用RACE 方法克隆了经MC-LR 处理后差异表达明显的鲢鱼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK 基因cDNA 全长,并对其进行了序列分析,然后通过半定量分析了经MC-LR 投与1、5、10 h鲢鱼肝脏组织PEPCK 表达水平。结果显示：鲢鱼PEPCK 基因cDNA 全长2 605 bp,包括101 bp 的5'' 端非翻译区、564 bp 的3'' 端非翻译区、1911 bp 的开放阅读框,编码636 个氨基酸。将鲢鱼PEPCK 基因cDNA 核酸及氨基酸序列与GenBank 中已发表的其他几种鱼类的相应序列进行比对,表明鲢鱼PEPCK 与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK 在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK 具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP 三磷酸链结合的激酶1 和激酶2 基序。另外,鲢鱼投予MC-LR 后,肝脏组织PEPCK 经过1、5、10 h 的表达量均有显著升高,说明鲢鱼投予MC-LR 1 h内该基因即被诱导表达,且在10 h内皆维持较高的表达水平。这与微囊藻毒素作用有关,推测与微囊藻毒素解毒过程相关。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

一种自制的RNA分离试剂及其在鱼组织总RNA提取中的应用

【目的】尝试自制一种价格低廉的RNA分离试剂,并检验其应用效果。【方法】以商业化的TRizol Reagent为对照,使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA,采用分光光度计法、变性琼脂糖凝胶电泳法和RT-PCR检测其品质,并用提取的总RNA合成草鱼皮肤cDNA。同时使用自制RNA分离试剂提取斑马鱼总RNA,通过RT-PCR进行E2F5基因全长（1 092 bp）的克隆,构建其真核和酵母表达载体并测序。【结果】使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA的品质与用TRizol Reagent提取的总RNA品质相当,用之成功地合成了草鱼皮肤cDNA。使用自制RNA分离试剂提取得到了更高品质的斑马鱼总RNA,用之成功地克隆了斑马鱼E2F5基因,构建了其真核表达载体pcDNA3.1-flag-Zf E2F5和酵母表达载体pGAD GH-Zf E2F5。【结论】自制RNA分离试剂能够用于鱼类组织总RNA的提取,提取的总RNA能满足后续cDNA合成及RT-PCR克隆特定基因的需要。