克伦特罗单克隆抗体的制备及其初步鉴定

【研究目的】制备克伦特罗单克隆抗体（McAb）,为建立克伦特罗残留检测方法奠定基础。【方法】用偶氮化法将克伦特罗与钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）及卵清白蛋白（OVA）偶联,制备完全抗原,免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株以制备单抗,并对单抗的特异性、交叉反应性及抗原识别位点等特性进行了初步鉴定。【结果】获得了1H5、1H7、1D6、2F10四株杂交瘤腹水效价均在1：105以上。对沙丁胺醇交叉反应性测定,最小的是1D6,只有2.32%的交叉反应性。单抗相对亲和力1D6〉1H5〉1H7〉2F10。抗原识别位点分析结果表明,这四株单抗至少识别两个不同的抗原位点。选用1D6初步建立了竞争ELISA检测方法,检测限可达1ng/ml,为进一步研制残留检测试剂盒奠定了基础。     

环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描 (UV Scan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIP mAb,对CIP mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明BSA-CIP人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4;其中2号小鼠血清CIP抑制效价较高且IC50最低,达48.59μg/L,融合后筛选出Z3G12B3和Z2H8C10两株敏感特异的杂交瘤细胞,其两株细胞培养上清液效价为1:512,腹水效价为1:2.56×105,Z3G12B3株对CIP的IC50为2.47μg/L,与二氟沙星、沙拉沙星有小于0.03％的交叉反应性,与其他抑制物无交叉反应性。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIP mAb,为CIP残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。     

新霉素单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用碳二亚胺(EDC)法将新霉素(NEO)偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-NEO和包被原OVA-NEO,用红外扫描(IR)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-NEO免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立分泌NEOmAb细胞株,用体内诱生腹水法制备NEOmAb;对NEOmAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定.结果表明,成功制备了BSA-NEO人工抗原;筛选出1E9、4E8、1G1共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:2.56×103、1:1.28×103、1:5.12×103,腹水效价分别为1:5.12×105、1:2.56×105、1:1.02×106,1G1亲和常数(Ka)为3.75×1010(L/mol);1G1株对NEO的IC50为2.57 ng/mL,NEO mAb对庆大霉素、链霉素、土霉素、环丙沙星、二氟沙星等无交叉反应.试验获得了抗NEO高价、敏感、特异的mAb,可用于NEO残留检测的免疫学试验.     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的制备

本实验利用弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂,乳化病毒,制备免疫抗原,对BALB/c小鼠进行三次免疫。将免疫效价达到1：10000以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞株进行筛选,并通过有限稀释法将呈强阳性的杂交瘤细胞亚克隆3～4次,直到杂交瘤细胞阳性率达到100%。得到阳性株命名为2E3,对阳性株细胞进行扩大培养,并将细胞注入腹腔,提取腹水,测定细胞上清及腹水的效价,分别为10×25,10×26。利用亚类鉴定试剂盒测定单抗的亚类。鉴定结果为IgG1型。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法.用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合.经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7.C9,G10)亚类.经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1:1 600～1:3200,腹水效价为1:51200～1:102400.交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定簇,具有高度特异性.稳定性试验表明,制备的杂交瘤细胞株经连续传代25代和经3次冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体.抗CSFV McAb的成功制备,为进一步研究CSFV的生物学特性及其快速诊断方法的建立奠定了基础.     

抗雌二醇单克隆抗体的制备与鉴定

活化雌二醇（E2）C3处的酚-OH,与牛血清白蛋白（BSA）偶联,制备得E2的完全抗原,利用完全抗原免疫动物,采用单克隆抗体技术,经过细胞融合、克隆筛选、扩大培养、动物体内诱生腹水等过程,最后获得了E2的单克隆抗体,对纯化的单克隆抗体的性质鉴定,结果显示：其抗体效价为1:106,抗体属于IgG2a型;分子量为179000Da;E2单克隆抗体的亲和常数Kaff＝2.9×108L/mol。     

类圆环病毒因子P1结构蛋白表位肽抗体的制备及应用

旨为制备兔抗类猪圆环病毒因子P1的特异性抗体,对其在病原学方面的应用进行研究.采用人工合成选定的表位肽,将其与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔制备抗P1多克隆抗体,通过免疫组化对该多抗与P1的反应性进行检测.获得了抗P1多克隆抗体;免疫组化结果显示抗体可与P1病毒蛋白出现特异性反应.偶联后的P1表位肽具有免疫原性,...     

水稻小穗簇生突变体的遗传分析及其基因的初步定位

小穗簇生稻是发生于水稻穗部的一种突变体,复粒稻属于簇生稻的一种类型,为了进一步明确复粒稻中所含簇生基因Cl的遗传机理,本研究利用复粒稻与日本晴、R8258、H103、泸恢99配制4个杂交组合,获得杂种F1、F2分离群体,对F1、F2群体进行簇生性状的形态观察与遗传分析。结果表明,F1群体表现部分显性,F2群体出现3:1显隐性状分离,这表明该性状受1对不完全显性基因控制。利用Gramene数据库查得均匀分布于12条染色体上的695对SSR标记对复粒稻与日本晴,复粒稻与R8258两个杂交组合的F2群体进行了分析,发现第6染色体的RM454、RM20300、RM7434和RM162与Cl基因连锁,距离Cl基因的遗传距离分别为3.85cM,1.19cM,4.29cM和4.33cM。根据Gramene网站上这几个引物已测得的遗传位点,将Cl基因定位于RM20300和RM7434之间。这为Cl基因的分子标记辅助选择育种和图位克隆奠定了基础。     

水稻稀穗突变体的遗传分析及其基因的初步定位

水稻的穗形与其产量关系密切,也是研究的一大热点。利用60Co-γ射线辐射诱变水稻68902B,筛选到一个水稻稀穗突变体,暂命名为Oslp(Oryza sativa lax panicle)。研究了该突变体的主要农艺性状与稀穗的遗传方式,并对稀穗突变基因Oslp进行了分子定位。结果显示稀穗突变体Oslp的每穗粒数为104粒、二次枝梗数目为7个,它们都显著地少于原品种68902B每穗粒数的124粒和二次枝梗数目的 20个。遗传分析揭示突变体Oslp的稀穗性状受一对隐性核基因控制。将(籼稻品种261S×稀穗突变体Oslp)F2代中的稀穗个体作为定位群体,结合BSA和SSR分子标记技术,将基因Oslp定位在第7号染色体短臂的2个分子标记FR-3和FR-4之间,基因Oslp与FR-3和FR-4的遗传距离分别为0.6 c M和0.8 c M。     

淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备

旨在体外表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠制备单克隆抗体。用PCR扩增木薯淀粉磷酸化酶基因,将其克隆到原核表达载体(pET28a)中,经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶。用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫Babl/c小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价,取小鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞融合,制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并检测其亚型和抗体稳定性。重组质粒在E.coli中能高效表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠后取效价高的3#小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合,共获得15株抗体效价均达到10~5以上,能稳定分泌抗淀粉磷酸化酶抗体的细胞株,与钙调蛋白、牛血清白蛋白无交叉反应,抗体亚型鉴定其中13株为IgG型抗体,其中2株抗体性能非常稳定。本实验制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体效价高、特异性强、稳定性好,为后续木薯中淀粉磷酸化酶研究奠定基础。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测

将纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)制剂免疫BALB/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为1H8、1D4.用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG1亚类.间接ELISA效价测定结果1H8为1:105,1D4为1:106.TAS-ELISA实验结果表明此2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的从德国引进的番茄环斑病毒分离物、从美国ATCC引进的番茄环斑病毒分离物PV-100、PV-174、PV-239发生特异性反应,而不与同属其它3种病毒:烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)发生反应.     

甜玉米穗位高的QTL定位

选用穗位高有显著差异的甜玉米自交系T14和T4为亲本配制杂交组合,以330个F2单株为作图群体,用复合区间作图法在玉米全基因组上检测穗位高QTL。结果显示,在F2:3群体中检测到7个与甜玉米穗位高相关的QTL,分别位于玉米第3、4、8、9、10染色体上,可解释3.2%~13.3%的表型变异。这一结果有望为加快高产、耐密和抗倒伏育种进程,实现分子标记辅助选择提供理论依据。     

水稻节位生产力的初步研究

选用分蘖能力强的西农优1号和分蘖能力中等的冈优725两个籼型杂交中稻为试验材料,在群体条件下跟踪调查主茎各节位分蘖的消长变化,结果表明:在带蘖大苗移栽时,主茎节上存在着秧田节位、过渡节位、优势节位和劣势节位4个节位群;秧田节位群具有有效穗数最多、穗粒数较多的特点,而大田优势节位群具有穗粒数最多、有效穗较多的特点。     

蚕豆亚有限生长习性遗传规律分析及其基因初步定位

机械化是制约蚕豆生产的主要问题,而生长习性是影响机械化收获的主要性状.亚有限生长习性的种质具有重要的利用价值.本研究以无限生长习性品系(GF3)与亚有限生长习性品系(RE25,RF22)为亲本,构建F2和F2∶3群体(GF3×RF25,GF3×RF22,RF25×GF3),对蚕豆亚有限生长习性的遗传规律进行分析.结果 ...     

抗猫杯状病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

为了制备抗猫杯状病毒的单克隆抗体,并对其基本生物学特性进行鉴定。分别采用饱和硫酸铵方法、差速离心、氯化铯密度梯度离心方法对猫杯状病毒(FCV)进行纯化,将纯化的猫杯状病毒作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立抗猫杯状病毒单克隆抗体的杂交瘤系,鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明：本实验获得了2株稳定分泌特异性抗猫杯状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为D8、E5,其亚型均为IgM。获得的单克隆抗体与犬细小病毒(CPV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应。成功制备了抗猫杯状病毒单克隆抗体,为建立相关诊断方法奠定了基础。     

水稻株高及其构成因素数量性状基因座位的分子标记定位

应用具有８９个标记位点的Ｆ２群体的ＲＦＬＰ图谱，对控制水稻株高及其构成因素的数量性状基因座位进行定位等研究。共定位了３２个ＱＴＬｓ，其中涉及株高的有７个、穗长３个、第一节间长有２个、第二节间长和第三节间长各３个、第四节间长有６个、节间数和第一节间干重各有４个。     

水稻磷高效基因的初步定位

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素.植物磷营养高效利用通常与根的形态、根分泌物、膜与体内磷转运以及菌根等因素有关,表现为受多基因控制.本文通过前期筛选工作,获得1份耐低磷株系.利用230对SSR和InDel引物,对低磷材料所在的回交导入系群体进行了初步定位,定位结果显示,与磷利用效率相关的基因座位有两个OsPe5和OsPe7,分别位于第5染色体的InDel520与InDel529标记之间,与InDel525标记共分离,物理距离约为900kb,和第7染色体InDel703与InDel717标记之间,与InDel713标记共分离,物理距离约为1 400kb.     

抗伪狂犬病毒闽A株单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV-FA)免疫Balb/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4G9E9和4H9C9.这2株杂交瘤细胞株细胞培养上清和小鼠腹水效价(EusA)分别为1:6 400、1:12 800及1:12 800、1:25 600.特异性鉴定结果表明,各株单抗均不与猪瘟病毒、乙脑病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应,这2株抗PRV杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础.     

贵定云雾茶近红外识别模型的初步建立

为了快速、准确的鉴定贵定云雾茶的真伪,以贵州省各地茶叶为研究对象,应用近红外漫反射光谱技术对贵定云雾茶进行定性分析。结合判别分析法(discriminant analysis,DA),光谱范围选取4235.35~4252.46、5484.32 ~5497.04、5999.06~6310.39 cm-1,并采用SNV结合一阶导数、Norris平滑的光谱预处理方式,主成分因子数选5,建立识别模型。结果表明,模型的正确识别率达到88.6%。为快速准确识别茶叶提供了一种新思路。