芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。     

马铃薯野生种CHS基因cDNA的克隆与表达分析

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析.序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%～93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天表达量最高,而在光照前检测不到,光照前块茎为白色,随着光照时间的延长,其表层颜色因积累花色苷而变成紫红色.     

芒果GGPPS基因的克隆与表达分析

在植物中,异戊烯焦磷酸(GGPP)是赤霉素、胡萝卜素、叶绿素等异戊二烯类化合物的公共前体物质。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(Min GGPPS1)。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPS的全长基因并且为最大的ORF,全长为1 100 bp。与芒果Min GPS2(AFJ52722.1)氨基酸序列同源性为92%。蛋白质序列分析表明该序列含有两个DDx_(2-4)D保守基元(FARM和SARM)基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析表明,Min GGPPS1属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基。表达分析表明:Min GGPPS1在叶片中表达量最高,茎部表达量最低,青果果皮和成熟果果皮中表达量相似,在成熟果肉中的表达量大约是青果果肉表达量的5倍,暗示Min GGPPS1具有调控果肉后熟的功能。     

红皮香蕉CHS基因的克隆和表达模式分析

为研究查尔酮合成酶基因(CHS)在红皮香蕉[Musa acuminata ’Red Green’(AAA)]果实花青素生物合成过程中的作用,探究红皮香蕉中查尔酮合成酶(CHS)的生物学作用,为红皮香蕉果实颜色形成的分子机制研究提供理论基础。以小果野蕉(Musa acuminata)基因组为参考,对红皮香蕉[Musa acuminata ’Red Green’(AAA)]和天宝香蕉(Musa spp., AAA Group)进行差异转录组分析,结果中筛选出4个CHS差异表达基因,分别命名为MaCHS2-1、MaCHS2-2、MaCHS2-3、MaCHS2-4,将其克隆出来并进行生物信息学分析,以及不同的组织中的表达模式分析。结果表明：这4个MaCHS基因长度均为1 200 bp左右,均可以编码392个氨基酸,不存在任何信号肽,均属于非分泌蛋白。4个MaCHS的基因结构,保守基序高度相似,是查尔酮合成酶超家族成员。启动子中均含有与查尔酮合成酶调控功能相关的顺式作用元件,包括脱落酸响应元件(ABRE),MYB转录因子结合位点顺式元件,MYC转录因子结合位点顺式元件等。系统进化关系显示4个Ma...     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

芒果 ANS 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的cDNA长度为1252 bp,开放阅读框的长度为1056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

芒果DELLA-GAI基因及其启动子的克隆与分析

DELLA蛋白是赤霉素(GA)代谢通路中的受体因子,参与了数种环境信号、激素信号的系统反应。本研究采用同源克隆的手段,参考NCBI登录的‘阿方索’芒果的基因组数据,克隆了‘贵妃’芒果的DELLAGAI基因。其全长cDNA序列长2 120 bp,包含一个1 719 bp的开放阅读框(ORF),编码572个氨基酸,蛋白分子量为62.9 kD,等电点为5.10。由系统进化树分析可知,可可、榴莲、番木瓜、木薯等作物与该基因编码的蛋白聚为一类。经互作蛋白分析发现,芒果DELLA-GAI可能与GID1B、GID1C、SLY1、PIF4、JAZ1、GA3OX1等蛋白存在相互作用。启动子结构分析发现,该启动子主要含有MYB响应元件、光响应元件、植物抗病相关元件、MYC响应元件、MYB识别位点以及脱落酸和水杨酸响应元件。通过检测DELLA-GAI基因在‘贵妃’芒果果实不同发育阶段的表达情况发现,其在果实成熟期和完全成熟期表达量比较高,而在幼果期的表达量比较低。该基因及其启动子的研究与分析为探究‘贵妃’芒果果实色泽及其抗逆境调控机制提供了条件。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

芒果GGPPS小亚基基因的克隆、进化和表达分析

香叶基焦磷酸(GPP)是香味成分单萜的前体物质,而香味是芒果重要的品质性状。本研究克隆了芒果中GPP合成关键酶基因,即香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因(MinGGPPSssu),并开展了系统进化分析和表达分析。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到Min GGPPSssu全长约1 kb的c DNA序列。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPSssu的全长基因,且为最大的ORF。与近缘物种苦楝GGPPS1(KM108317)氨基酸序列同源性为83%。蛋白质序列分析表明该序列含有1个DDx_(2-4)D保守基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析,将Min GGPPSssu聚类到香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基所属的枝。表达分析表明,该基因在叶片中表达量最高,茎部表达量较低。果皮和果肉在芒果成熟前后表达量相似,但是在果皮中的表达量约为果肉表达量的3倍,推测其与果皮及叶片香味调控相关。     

芒果二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及其表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是花青素代谢后期重要的酶,是决定花青素从无色到有色的关键调控点。本研究以‘贵妃’芒果的果实为材料,采用同源克隆的方法克隆得到了一个二氢黄酮醇4-还原酶DFR基因。该基因c DNA全长为1 260 bp,开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。进一步扩增得到其基因组DNA,全长为3 022 bp,分析发现其含有五个内含子,在已报道植物中表现保守。系统发育分析发现芒果DFR蛋白与火鹤花、小麦和大麦等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的果皮中的DFR基因表达进行分析发现,绿色果皮中表达量较高,而黄色果皮中表达量较低,暗示DFR调控花色苷合成的功能待深入研究。     

芒果(Mangifera indica)黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及其表达分析

色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因是花色素代谢途径上的关键酶,属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶(2-ODD)家族,反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸,作用是催化柚皮素C3位羟基化,生成二氢山奈素(dhiydorkaempeforl,DHK)。本研究根据已经报道的F3H基因的序列设计兼并引物,采用RACE方法从芒果的果实中,克隆得到了一个F3H基因,其全长cDNA序列为1 182 bp,开放阅读框为1 092 bp,编码363个氨基酸,分子重量为40.82 k D,等电点为4.88。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测。对不同着色芒果品种中的F3H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。通过系统进化树分析发现芒果中黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因编码的蛋白与荔枝、可可、柚子等植物的亲缘关系比较近。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

芒果八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)影响类胡萝 卜素的合成,是合成途径中关键基因.为了研究芒果果实中PDS基因的功能,本试验采用RACE方法从'贵妃'芒果果实中克隆得到了 一个八氢番茄红素脱氢酶(PDS),该基因全长cDNA序列为1 820 bp,开放阅读框为1 650 bp,编码549...     

擎天凤梨花色素合成关键基因CHS、F3'H和DFR的克隆及表达分析

擎天凤梨‘Ostsra’是一种观赏红色苞片为主的高档盆栽花卉。一般认为植物苞片的呈色物质除叶绿素外多来源于花色素,而CHS、F3'H和DFR是在花色素的合成过程中的关键酶。本研究采用采用简并引物及同源克隆法获得了881 bp的CHS基因,编码276个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364270;采用cDNA全长文库构建、EST批量测序及目标单克隆序列测通法,获得了F3'H和DFR基因。F3'H基因长1 176 bp,可编码325个氨基酸序列,GenBank登录号为KX364271;DFR基因长1 209 bp,可编码167个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364272。采用实时定量PCR法检测CHS、F3'H和DFR在‘Ostsra’苞片呈色过程中的表达变化,结果表明,3个基因在苞片变色过程中(绿苞-半红苞-全红苞)都呈现出递增的趋势,即随着苞片颜色的变深,3基因的表达量逐渐增加,全红状态时,表达量最高,而作为对照的绿叶,表达水平都是最低的。     

橡胶草多聚泛素基因TkUBQ6基因的克隆及其表达分析

泛素/26S蛋白酶体途径(ubiquitin/26S proteasome pathway,UPP)调控植物生长发育以及抗病抗逆反应等过程,多聚泛素蛋白(UBQ)为泛素单体聚合而成的聚泛素蛋白,主要参与UPP途径的蛋白质水解过程,是一个可重复利用的信号分子,可以识别靶蛋白.为鉴定橡胶草中UBQ基因的结构与功能,本研究从...     

苦荞中查尔酮合成酶基因（CHS）的克隆

获得完整的苦荞查尔酮合成酶基因（CHS）信息并评价其进化地位,对分子辅助选育高黄酮含量的苦荞品种具有重要的指导意义。用RACE法克隆苦荞CHS基因,用生物信息学手段分析预测苦荞CHS基本理化性质和同源性,用临接法构建了该酶的系统发生树。获得1250 bp的CHS cDNA全长,含241 bp的3’UTR和185 bp的5’UTR;等电点（pI）和分子量（Mr）分别为5.33和35340.75 Da;克隆获得975 bp的开放性阅读框（ORF）。预测该基因编码含325个氨基酸残基的蛋白,氨基酸同源比对结果表明,苦荞CHS与蓼科的虎杖相似性很高;临接法构建的系统发生树结果表明,苦荞CHS与其他双子叶植物有共同的起源,与蓼科的金荞麦、甜荞、虎杖及石竹科的满天星亲缘关系较近。成功获得苦荞CHS基因的cDNA全长,克隆出完整的ORF,并确定了苦荞中该酶的进化地位和方向。     

茶树一个冷诱导基因的克隆及其表达分析

研究茶树低温驯化的分子机制,不仅对阐明多年生植物抗冻性有重要的理论意义,也有助于茶树抗冻品种的选育。本研究运用RACE技术从茶叶中克隆出一个冷诱导基因CsCOR1的全长cDNA序列,并通过Real-time RT PCR方法分析了该基因在低温、高渗和外源ABA处理时的表达状况。结果显示,CsCOR1 cDNA包含一个推定的ORF,编码一86个氨基酸的多肽。该多肽由N-端的信号肽和富含甘氨酸、精氨酸和脯氨酸的C-端两部分组成,其成熟蛋白中有两个重复的13肽段。CsCOR1基因的表达可被低温和脱水胁迫剧烈上调,可被外源ABA中度上调。     

陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析

 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565 bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。