金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药性分析

目的探究扁桃酸对金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)活性的抑制作用及其分子机制。方法采用二倍肉汤稀释法和平板涂布法研究扁桃酸对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用;测定金黄色葡萄球菌在含有不同质量浓度扁桃酸的培养基中的生长曲线;采用结晶紫染色法测定扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响;通过荧光共振能量转移试验(FRET)、分子对接技术和分子动力学模拟技术研究扁桃酸对SrtA活性的抑制作用及其分子机制。结果扁桃酸对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均大于1 024 μg/mL,在试验质量浓度范围内(0、64、128、256、512和1 024 μg/mL)对金黄色葡萄球菌及其生长基本没有影响;不同质量浓度扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜减少的总量有细微差异并形成一定抑制作用,并呈质量浓度依赖性;扁桃酸对SrtA活性有一定的抑制作用,其IC₅₀为(66.15±24.39) μg/mL;扁桃酸通过多种分子间作用力与Pro-163、Val-166、Gly-167、Val-168、Ile-199和Leu-169残基紧密结合,使SrtA的构象改变从而降低活性。结论扁桃酸可以与SrtA的活性中心紧凑结合并相互作用形成稳定的复合物,最终抑制SrtA的生物活性,具有成为抗金黄色葡萄球菌感染抑制剂的潜力。     

毛兰素缓解金黄色葡萄球菌腹膜炎的作用机制

采用微量肉汤稀释法、荧光共振能量转移试验和分子对接技术,分别探究毛兰素对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用、对分选酶A(Srt A)的抑制作用及其作用的分子机制;通过构建小鼠腹膜炎模型,评价毛兰素对金葡菌腹膜炎的缓解作用。结果表明:毛兰素对金葡菌的体外最小抑菌质量浓度为512μg/m L,最小杀菌质量浓度大于1024μg/m L;毛兰素对SrtA活性有明显抑制作用,IC50为(20.91±2.31)μg/m L;毛兰素以紧凑的构象结合至SrtA的活性中心,与SrtA形成稳定的复合物来影响SrtA的生物活性;毛兰素对金葡菌引起的腹膜炎有良好的缓解作用,可减轻金葡菌所导致的小鼠脓肿症状。     

咖啡酸通过抑制分选酶A治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠

利用荧光共振能量转移试验(FRET),测定咖啡酸对金黄色葡萄球菌分选酶A(Sortase A,Srt A)的抑制作用;利用蛋白结合试验,验证咖啡酸通过抑制Sortase A的活性影响金葡菌黏附于纤维蛋白原;通过构建小鼠腹膜炎模型,观察咖啡酸对金葡菌引起感染的治疗作用。结果表明:咖啡酸对Sortase A活性有明显的抑制作用,咖啡酸质量浓度为256μg/m L时,抑制率达到88.90%,IC_(50)为(37.13±4.55)μg/m L;咖啡酸对金葡菌的黏附有一定的抑制作用,当咖啡酸质量浓度为256μg/m L时,黏附率为18.77%;咖啡酸对金葡菌引起的腹膜炎有一定的治疗作用,给药组小鼠脓肿程度降低,腹腔载菌量显著减少。这说明咖啡酸可能成为金葡菌感染治疗药物研发的先导化合物。     

芦丁对金黄色葡萄球菌Sortase A的抑制作用

应用分子克隆技术,依照GenBank中金黄色葡萄球菌Sortase A基因序列设计引物,构建重组表达载体;采用荧光淬灭检测法观察芦丁对金黄色葡萄球菌Sortase A活性的抑制作用,并通过纤维蛋白原结合试验考察芦丁对由Sortase A介导的金黄色葡萄球菌黏附纤维蛋白原的影响.结果表明:成功构建了重组表达载体pET-Srt△N59,并纯化出Sortase A蛋白.荧光检测结果显示,芦丁对Sortase A的活性具有一定的抑制作用.当芦丁浓度为128,64,32,16,8μg/mL时,对Sortase A的抑制率分别为63.58％,62.80％,47.43％,20.37％,13.26％,IC50为57μmol/L;纤维蛋白原结合试验表明,芦丁对金黄色葡萄球菌的黏附具有一定的抑制作用.当芦丁浓度为64 μg/mL时,黏附率为27.97％,与阴性对照组相比显著降低(P＜0.01).     

金黄色葡萄球菌蛋白A基因的克隆

[目的]获得SPA蛋白的IgG结合结构域的基因克隆。[方法]采用优化的CTAB法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,通过PCR扩增获得SPA基因。[结果]金黄色葡萄球菌基因组DNA的纯度较高,完整性好,扩增获得了SPA基因。[结论]改进的CTAB法适用于金黄色葡萄球菌DNA的提取．且成功地获得了SPA基因。为进一步构建SPA非融合表达奠定了基础。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的制备

为获得稳定性好、特异性强、效价较高的抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体,用热灭活的金黄色葡萄球菌wol-04菌体抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为筛选抗原进行克隆筛选,并对各株单抗的生物学特性进行分析和鉴定.结果表明:试验获得了3株稳定分泌SPA单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中单克隆抗体3B11、4F7为SPA表面抗原表位的单克隆抗体,与金黄色葡萄球菌wol-04菌体和SPA有较强的免疫反应性,免疫球蛋白亚类分别为IgG1和IgG3,具有稳定性好、特异性强、效价较高的特点.     

绿原酸抑制金黄色葡萄球菌机理研究

为探索绿原酸(CGA)抑制金黄色葡萄球菌增殖的机制,通过检测β-半乳糖苷酶的变化反映细菌细胞膜通透性的变化,凝固酶的活性反映细菌致病力;用Bradford法、DNS法和DNP法分别检测可溶性蛋白质量浓度、还原糖利用能力和丙酮酸质量浓度的变化反映细菌代谢的改变.结果显示CGA处理金黄色葡萄球菌后菌液中β-半乳糖苷酶出现泄漏,且漏出量与CGA质量浓度呈量效关系,无血浆凝固现象,菌液中还原糖质量浓度急剧升高,可溶性蛋白质量浓度降低量超过50%,丙酮酸质量浓度升高5.34%,与对照组相比差异极具统计学意义(p<0.01),表明CGA可能通过改变金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性,阻碍物质和能量的代谢及细菌蛋白合成而达到抑菌作用.     

PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。     

猪体内金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌耐药性调查及耐药基因分布研究

2010年从广东省不同地区230头猪的淋巴结样品中分离鉴定出90株葡萄球菌,其中金黄色葡萄球菌19株,凝固酶阴性葡萄球菌71株.采用琼脂稀释法检测其对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR方法检测13种耐药基因的携带情况,运用统计学方法分析猪体内金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的耐药性和耐药基因分布情况的差异.结果显示葡萄球菌对大环内酯类、林可胺类和四环素类抗生素的耐药率较高(>80%).金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌对多数药物耐药情况及耐药基因的携带情况差异不显著,但对苯唑西林的耐药率及linA、ermB基因的携带率差异显著(P<0.05),凝固酶阴性葡萄球菌明显高于金黄色葡萄球菌.     

不同加工方式对EGCG抑制金黄色葡萄球菌活性作用的影响

[目的]研究经不同加工处理后表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响,从而为EGCG在食品生产加工中的抑菌应用提供依据。[方法]利用3种不同加工方式对EGCG进行处理,采用最低抑菌浓度测定法(MIC法)与纸片琼脂扩散法(KB法)检测EGCG的抑菌效果,利用Baird-Parker平板计数法检测EGCG对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制效果。[结果]EGCG抑菌能力随着浓度的增高而提升。相同浓度下,EGCG经过不同加工方式后抑菌能力大小依次为巴氏杀菌法(72℃,20 s)高压蒸汽灭菌法(121℃,15 min)薄膜过滤法(0.22μm),最低杀菌浓度(MBC)依次为0.062 5、0.125 0和1.000 0 mg/m L,经巴氏杀菌法处理的EGCG抑菌效果最强。而EGCG在牛奶中的抑菌作用不显著。[结论]在多种食品加工条件下,EGCG对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。     

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3~5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶生理功能分析

为了研究金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶的功能和作用,克隆该基因的全长序列,在一氧化氮合酶基因缺陷菌株的基础上,构建一氧化氮合酶过表达菌株,进行表型验证,研究NO对细菌表型的影响。结果显示:一氧化氮合酶缺失使细菌自溶速率加快,抗氧化杀伤能力减弱,生物被膜生成能力降低、缺失和过表达均会影响细菌正常的生长周期和速率。外源性NO对野生菌株、敲除菌株和过表达菌株生物被膜有不同影响显示,金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶还参与了外源性NO对生物被膜的调控。一系列表型结果表明:金黄色葡萄球菌内源性NO作用不仅仅阻断Fenton反应、增强过氧化氢酶活性,还可以作为一种信号分子调控细菌基因的转录和表达。     

乙酸乙酯沙蚕提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性研究

为探讨沙蚕体内生物活性物质的抑菌活性,采用乙酸乙酯溶剂对沙蚕体内生物活性物质进行提取,提取物对金黄色葡萄球菌进行药敏试验。结果表明,乙酸乙酯沙蚕提取物对金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌活性,其最小抑菌浓度(MIC)为0.195 mg/ml。     

赪桐提取物抗菌活性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌机理

[目的]揭示赪桐提取物(Extracts from Clerodendrum japonicum,EFC)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌机理,为临床抗病原菌感染药及植物杀菌剂的研发提供理论依据.[方法]采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌对EFC的敏感性,明确EFC的抗菌活性;通过试剂盒、流式细胞仪及扫描电镜等测定EFC作用后金黄色葡萄球菌细胞膜、细胞壁、三羧酸(TCA)循环、可溶性蛋白、胞内活性氧(ROS)水平、细胞凋亡及形态结构的变化,研究EFC的抗菌机理.[结果]EFC对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌3种供试细菌均具有抗菌活性,其中对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强,其抑菌圈(IZ)、最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL.经EFC作用10h后,金黄色葡萄球菌的乳酸脱氢酶(LDH)、钾离子(K+)及碱性磷酸酶(AKP)外泄分别显著增加72.0%、43.0%和78.0%(P<0.05,下同),琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性分别显著下降80.0%和36.4%.金黄色葡萄球菌经EFC作用24 h后,与对照组相比,5MIC(2.50 mg/mL)、10MIC(5.00 mg/mL)和20MIC(10.00 mg/mL)组的胞外蛋白含量分别上升28.6%、41.8%和61.5%,胞内蛋白含量分别下降40.9%、61.3%和82.5%,胞内ROS水平分别增加9.1%、33.5%和51.0%,细胞凋亡率分别增加24.0%、50.6%和72.8%.经EFC作用24 h后,扫描电镜下的菌体形态结构不规则、萎缩、畸形.[结论]EFC通过破坏金黄色葡萄球菌细胞壁和细胞膜的完整性及通透性,影响蛋白合成,导致TCA循环减慢而发挥抑菌作用.     

木质素过氧化酶对双酚A类化合物的分子动力学模拟

为了解双酚A类化合物(BPAs)与木质素过氧化物酶(Li P)结合位点的结合构象及其相互作用机理,采用SYBYL-X1.3中分子对接的方法对BPA、BPF、BPAF、BPQ、BPB、BPC、BPS、BPE、BPAP等具有突出特点的双酚A类化合物与Li P进行对接研究,并利用GROMACS软件进行分子动力学模拟。通过对对接最稳定化合物BPQ和常用化合物BPA的模拟参数具体分析,找到了Li P的活性位点为HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46;找到了该酶被识别的氢键结合位点中的氨基酸残基,BPQ通过氢键连接了PRO83.O(id141)、ASP183.OD2(id470)和ASN182.HD21(id1221),而BPA通过氢键连接了PRO83.O(id141)、ARG43.HH21(id818)。氨基酸残基对Li P与双酚A类小分子化合物的降解起到重要作用。     

重组溶葡萄球菌酶对金葡菌诱导试验性小鼠乳腺炎的防治研究

试验采用重组溶葡萄球菌酶探讨了对小鼠试验性乳腺炎的治疗效果.利用微量肉汤稀释法测定了重组溶葡萄球菌酶时乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC).将18只泌乳8～10 d的BALB/C母鼠随机分成正常组、阳性对照组和试验组.阳性时照组和试验组母鼠经第4对、第5对乳腺乳头管注入50μL 2.0x105CFU的细菌悬液.试验组攻菌出现症状后,每个乳腺经乳头管注入1 U·mL-1的重组溶葡萄球菌酶稀释液50μL,间隔12 h 1次.观察小鼠的临床症状,测定体温、血常规等指标.接菌66h后,颈静脉放血处死小鼠,取小鼠乳腺进行细菌计数和病理组织切片制作.结果显示,重组溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.001 U·mL-1,MBC值为0.063U·mL-1.病理组织观察显示,正常组的腺泡结构完整,而阳性对照组的乳腺组织局部被破坏,间质增宽,炎性细胞浸润严重,试验组的组织结构基本正常,有轻度充血.说明重组溶葡萄球菌酶能有效地减少细菌感染,降低组织的损伤程度,对乳腺有一定地保护作用.     

食品中金黄色葡萄球菌的快速检测

本文介绍一种检测食品中金黄色葡萄球菌的快速方法,甲胶乳颗粒与人血浆制成试剂(PS胶乳),分别与BP和MSEY培养基中分离培养的菌落作平板凝集反应。在BP培养基中的金黄色葡萄球菌,98.1％为PS胶乳凝集阳性;在MSEY培养基中95.9％为PS胶乳凝集阳性。用BP培养基和PS胶乳组合,其检出率和特异性均高于其他组合,并可在数分钟内直接检出平板上的金黄色葡萄球菌,且与凝固酶试验具有很高的一致性。     

大蒜素对金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究

[目的]研究不同种类,不同处理方法蒜液抑菌效果及大蒜素最低抑菌浓度和对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响,为进一步利用大蒜素资源提供理论依据。[方法]用大蒜提取蒜液为材料,定硫法测定其中蒜素含量,研究大蒜素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。[结果]大蒜液中含有的大蒜素对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,经过机械破碎或挤压得到的蒜液抑菌效果比蒸煮后蒜液好,紫蒜抑菌效果优于白蒜,蒜素的最低抑菌浓度为32 mg/ml。细菌生长曲线表明,对数生长期的金黄色葡萄球菌对大蒜素敏感,而稳定期的菌体抑制作用较弱。[结论]大蒜素在体外对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌作用。     

短短芽孢杆菌DFG对金黄色葡萄球菌的抑制效果

为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)DFG菌株的开发应用提供参考,采用不同化学物质处理方法结合琼脂打孔法研究不同培养基、接种量和发酵时间对其发酵液抑菌活性的影响,并在此基础上研究温度、蛋白酶、酸碱、紫外线照射和反复冻融等因素对其抑菌物质稳定性的影响。结果表明:NA培养基培养的DFG菌株其发酵液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用最强,抑菌圈直径达2.4cm;发酵液经100℃处理30min,抑菌率仍达65%;对酸碱也具有较强的稳定性;经紫外线照射和反复冻融后性质稳定;对胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,可用有机溶剂对短短芽孢杆菌DFG菌株抑菌物质进行部分萃取。