草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

蟠桃磷脂酶D基因RNAi表达载体构建

[目的]构建蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体.[方法]以英格尔蟠桃为材料,将CTAB改良法提取的蟠桃总RNA反转录成cDNA作为模板,通过RT - PCR扩增约347 bp的保守片段,将目标片段插入到pSK - int中间表达载体中,获得pSK - PLD - RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中,构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi.[结果]经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi已构建成功.[结论]蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体的构建为进一步通过RNAi技术延长蟠桃果实的贮藏寿命奠定了基础.     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

非洲菊f3h基因的克隆及反义表达载体的构建

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是植物花青素合成代谢中早期重要关键酶之一,对花色起着重要的调控作用.根据其它物种的f3h基因设计简并引物,通过RT-PCR技术,从非洲菊中克隆到500 bp的片段,经Blast N比时,证实该片段为非洲菊f3h基因保守片段.将其反向插入到高效表达载体pCAMBIA1304+CaMV 35S启动子下游,通过PCR鉴定和双酶切鉴定表明成功构建高效反义表达栽体pCAMBIA1304+-antif3h,并转化到根癌农杆菌LBA4404形成工程菌株,作为今后研究非洲菊花色调控机制以及培育新品种的有力工具.     

甘蓝型油菜pep基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义、利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序．测序结果表明：扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95％．用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBII21．N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到湘油15号中。     

拟南芥WRI1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥WRI1基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 287 bp.将拟南芥WRI1基因反向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体.     

黄瓜硝酸还原酶基因(CsNR)序列分析及正反义表达载体的构建

为进一步研究CsNR的作用机制,从黄瓜幼叶中克隆获得硝酸还原酶基因编码区序列(CDS)全长和片段(CsNR;EC1.6.6.1),并运用生物学软件对该基因进行序列分析。其中CDS全长2 748 bp,编码915个氨基酸;CDS片段360 bp。CDS全长和p ROKⅡ经Kpn I单酶切和连接,构建了CsNR正义表达载体;CDS片段和p ROKⅡ经Kpn I和Sac I双酶切,构建了CsNR反义表达载体。通过与其他高等植物NR蛋白进行同源性比对分析,结果发现,CsNR基因的氨基酸序列与甜瓜、烟草、拟南芥、油菜NR基因编码的氨基酸序列高度同源,其中与甜瓜NR蛋白之间同源性最高,为98.25%。     

蝴蝶兰ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

［目的］克隆蝴蝶兰ACC合成酶cDNA片段,构建其反义表达载体。［方法］根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶的基因序列,设计并合成了1对引物,通过RTPCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的cDNA片段,将其连接到MD19T质粒载体上进行测序。用XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接,构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结果］获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cDNA片段,测序结果显示,该片段与参考的已报道序列具有98.92%和76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点,进行载体构建,构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结论］成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体,为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的cDNA片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码PEPCase基因的cDNA片段(886 bp),测序结果显示其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%、84.37%、81.54%、81.25%、78.71%.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.     

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。     

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明：该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用HindⅢ和XbaⅠ切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。     

玉米叶片cDNA文库构建及Cah墓因克隆

从玉米叶片中提取总ＲＮＡ后，再利用ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－纤维素亲合层析往，从中分离出ｍＲＮＡ，然后以ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－ＸｂａＩａｄａｐｔｏｒ作为引物，ｍＲＮＡ作为模板，合成相应的ｃＤＮＡ．并定向克隆进λＧＥＭ－４载体，构建出滴度为２×１０５ｐｆｕ的玉米叶片ＣＤＮＡ文库、最后，利用寡核苷酸探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选到８个阳性克隆。     

金黄色葡萄球菌fbB基因D2-D3编码区克隆及其植物表达载体构建

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用.因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标.本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行Nco Ⅰ和Eco 065 Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列.结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体.该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础.     

玉米ZmCBL6基因的克隆及其植物表达载体构建

类钙调磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like proteins,CBLs）是植物中1类重要的Ca2＋结合蛋白,由其所介导的Ca2＋信号途径广泛参与植物对多种非生物胁迫和某些生长发育信号的应答反应。本论文以水稻OsCBL6序列在GenBank数据库进行TBLASTN查询,获得其在玉米中推测的同源基因ZmCBL6的全长cDNA序列,然后用RT-PCR方法对ZmCBL6基因的编码框cDNA进行了克隆,用生物信息学方法对其编码蛋白的功能域、系统进化和亚细胞定位等进行了分析,并构建了其植物表达载体,为进一步研究其亚细胞定位和通过转基因植物等验证其功能奠定了基础。     

动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.     

Dip法获得转反义磷脂酶Dγ( PLDγ)基因拟南芥植株

在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下，以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料，用Dip法进行转基因实验，对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中(含5％蔗糖，0．04％吐温—80)，每次浸染10min，间隔3天浸染一次，共浸染3次。每次浸染后将植株横放于暗箱中24h，再置于22—24℃的光照下正常生长。待种子收获后在含有卡那霉素70mg/L的选择培养基中选择转化植株。PCR及PCR—Southem blot分析检测，该方法的转化率每100粒种子可高达2％。     

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR02（Fe^3＋-螯合物还原酶）基因,并将FR02基因构建到了植物高效表达载体pCB302中。通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern blot检测证明FR02基因正向的插入了苹果基因组中。以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10．8％。FR02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路。