甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

油菜BnROP1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育

基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为AT3G51300（ATROP1）,采用荧光定量PCR方法,对油菜中该基因（BnROP1）在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,在此基础上构建了ATROP1基因的microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得12株转基因苗。T1代转基因苗的表型观察发现,转基因植株大多出现角果数量减少或不结实、无花粉、花药萎缩以及小孢子数量大大减少的表型。对转基因T2代多个株系的荧光定量PCR分析说明,目标基因的干扰是有效的,靶基因的表达水平都显著下调。说明转基因植株的雄性不育表型和ROP1基因的表达沉默有关,ROP1基因不仅控制了花粉管的极性和伸长,还和小孢子的正常发育密切相关。     

甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因BnSCP-2的克隆与表达

固醇载体蛋白2(SCP-2)是一类小分子碱性蛋白,参与细胞内脂质运输、脂肪酸代谢以及过氧化物酶体β-氧化等过程。利用同源序列设计引物进行PCR扩增,克隆得到甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因的c DNA序列,命名为BnSCP-2。BnSCP-2的开放阅读框长372bp,编码一个由123个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的蛋白质相对分子质量为13.52kD,等电点为9.35。SCP-2蛋白氨基酸序列非常保守,系统进化分析表明BnSCP-2与拟南芥SCP-2同源性最高。荧光实时定量PCR结果表明BnSCP-2在检测的各个组织均有表达,其中花和花蕾中的表达量最高;赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等可显著诱导幼苗中该基因的表达,推测该基因可能参与调控幼苗生长发育。     

抗草丁膦G1和G2转基因大豆对除草剂耐性评价及田间节肢动物影响研究

为评估转基因大豆的环境生态风险,本研究在田间和室内评价了抗草丁膦转基因大豆G1和G2对靶标除草剂草丁膦和非靶标除草剂草甘膦、灭草松和烯禾啶的抗性,同时明确了G1和G2对田间节肢动物多样性的影响。结果表明:在田间喷施1、2和4倍浓度的靶标除草剂草丁膦后14 d,G1和G2均能正常生长,株高随喷施浓度增加略有下降,分别为33.8,31.9,29.1 cm和32.9,30.3,28.3 cm,但与G1、G2清水对照和转基因受体天隆一号清水对照相比无显著差异;喷施后28 d,G1和G2植株均能正常生长且株高有所增加;喷施不同浓度草丁膦表现为转基因受体受害率平均为99.4%～100%,而G1和G2平均受害率为0.8%～6.8%,且随着喷施时间的延长,G1和G2的受害率有所减缓。喷施不同浓度非靶标除草剂草甘膦和灭草松后,转基因大豆G1和G2及受体大豆均出现明显药害症状,受害率为92.3%～100%,且于喷施28 d后植株全部死亡;而喷施不同浓度非靶标除草剂烯禾啶,G1、G2及受体大豆均能正常生长,平均受害率为10%以下,植株株高与清水对照无显著差异。结果表明G1和G2大豆只对靶标除草剂产生耐性,而...     

GAPC和AT2G36580在油菜不同组织器官中的表达差异及其与雄性不育的关系

基于油菜纯合双显性雄性核不育恢复系的芯片表达谱分析结果,本文选择与糖代谢途径相关的两个基因GAPC和AT2G36580,采用荧光定量PCR方法对其在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行分析。结果表明,GAPC和AT2G36580在根、茎、叶、花和角果中均有表达,其中在根中表达量最高,花中表达量最低;GAPC在不育株花蕾发育的减数分裂至单核期被显著抑制,三核期表达量上升,而在可育株花蕾减数分裂至单核期表达量较高,四分体至单核期表达量最高(是减数分裂期的5.06倍),三核期表达量下降;AT2G36580在不育株花蕾发育中一直被抑制,但在可育株花蕾减数分裂至单核期表达量较高,四分体至单核期表达量最高（是减数分裂期的1.69倍）,三核期表达量显著下降。进一步对雌雄蕊中的表达量进行分析表明,这两个基因均在可育植株雄蕊中表达量高,分别是不育株雌蕊（参照）的9.11倍和4.47倍,在雌蕊中表达量比参照显著低;与参照比,在不育株雌雄蕊中表达被显著抑制。初步结果表明GAPC和AT2G36580在油菜恢复系J10中具有相似的表达模式,可能是通过影响雄蕊发育过程中的糖代谢而参与花蕾发育的调控,与不育有密切关系。     

甘蓝型油菜种子特异性表达 fad2基因的ihpRNA载体构建

旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA 植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和 酶基因( fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM - T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建 fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式 连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止 子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建 具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNF IRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

南方根结线虫Mi-eft2基因RNAi沉默效应研究

以南方根结线虫延长因子2基因(Mi-eft2)T克隆质粒为模板,克隆该基因的3个部分片段(各200 bp),作为体外合成ds RNA的模版,利用该ds RNA(F1ds,F2ds,F3ds)干扰南方根结线虫2龄幼虫(J2)的Mi-eft2表达。结果显示,利用real-time PCR作为检测方法,干扰处理后的J2线虫Mi-eft2的表达量(F1、F2、F3),与对照处理的J2线虫Mi-eft2的表达量(F0)相比,分别降低了21%、69%、0.02%。将经过干扰处理的J2线虫和作为对照处理的J2线虫(500头/株)分别接种5株番茄,培养45 d后观察表型。发现干扰处理后J2线虫与对照处理的J2线虫接种番茄后产生的根结数相比较,分别减少了57.09%、68.94%、7.01%。说明Mi-eft2表达的沉默效应会使南方根结线虫对番茄造成的危害程度相应降低,也说明了利用RNAi干扰该基因表达的方法有利于对南方根结线虫病害防治方法的探索。     

At2g04450启动子的克隆和启动活性分析

为明确拟南芥At2g04450启动子对靶标基因表达的启动作用,根据已报道的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆At2g04450上游调控序列,并与pBAR-GUS中间表达载体相连构建植物表达载体p04450p-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性以及病原菌PstDC3000对该启动子的诱导表达效果。结果表明:获得At2g04450上游调控序列,该序列不仅具有启动子活性,并且具有组织特异性,GUS基因主要在根特异表达;病原菌PstDC3000对该启动子的表达没有诱导作用。本结果将为研究At2g04450的功能奠定基础。     

甘蓝型油菜BnTLP1基因的菌核病抗性研究

前期发现甘蓝型油菜类甜蛋白基因BnTLP1在菌核病抗性品种中的表达丰度高,为探究和解析其作用机制,通过叶片接种核盘菌,对拟南芥BnTLP1过表达转基因株系、野生型对照和突变体tlp1-1之间的抗菌核病效果进行分析。结果表明：过表达BnTLP1拟南芥的病斑面积显著小于野生型对照,而tlp1-1病斑扩展大于对照,即BnTLP1正调控菌核病抗性。亚细胞定位表明BnTLP1定位于细胞膜和细胞核,暗示其不仅在细胞膜发挥抑菌功能,而且在核内行使其它功能。不同防御反应信号通路的标志基因表达分析表明,茉莉酸/乙烯途径可能在早期参与了BnTLP1介导的菌核病抗性。     

甘蓝型油菜NCa雄性不育系不育类型及育性遗传

7个不同的NCa雄性不育系套袋自交，平均结角率为0．68％，平均亲和指数为0．008；在开放授粉条件下平均结角率86．29％，平均亲和指数11．69。用50个来源不同的甘蓝型油菜同时测定Pol雄性不育系、NCa雄性不育系、nap雄性不育系，结果表明NCa雄性不育系与Pol雄性不育系和nap雄性不育系之间的恢保关系差异明显。根据NCa雄性不育恢复基因的遗传分析，初步认为NCa雄性不育的恢复基因为1对恢复基因。     

一个甘蓝型油菜DGCMS雄性不育系的花器形态及细胞学研究

花器形态和花药发育的解剖学观察结果表明,ＤＧＣＭＳ－宜３Ａ中表现波里马细胞质雄性不育（ｐｏｌＣＭＳ）的植株,花花器形态和花药发育的解剖学特点与ｐｏｌ ＣＭＳ相同,即在高温条件下,花瓣较小,表现彻底不育,无花粉囊的分化;在低温条件下,花瓣变大,表现部分雄性不育,可分出１－４个花粉囊,并产生一定数量可育花粉。表现质核不育（ＤＧＣＭＳ）的植株,在高温条件下,花瓣小,表现彻底的ＰｏｌＣＭＳ不育,无花粉囊的     

芝麻细胞色素P450超家族的成员鉴定及SiCYP703A2的功能验证

细胞色素P450(CYP450)超家族广泛参与初生和次生代谢物质的生物合成,其中CYP703家族基因参与拟南芥、水稻等的花药发育.本研究利用生物信息学方法,从芝麻基因组中鉴定出303个CYP450基因,发现它们分为9个家族簇(clan),43个基因家族,随机分布于16个连锁群中.CYP703家族是71 Clan的成员之...     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

菜心 BclUBE2 基因的克隆与表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得 cDNA 全长 459 bp 的 E2 基因,命名为 BclUBE2。该基因编码 153 个氨基酸,分子量为 17.24 ku,理论等电点为 5.37,为亲水性非分泌蛋白。结构分析显示,该蛋白含有一个泛素结合酶E2 活性位点、一个 WD 重复序列和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析发现,菜心 BclUBE2 蛋白与芸薹属芜菁和油菜的亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明,菜心 BclUBE2 基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达,且表达丰度和变化趋势不同。在低温胁迫下,根中的表达量呈现先降低后升高的变化趋势,且在处理 1 h 时表达量最低;在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势,茎和叶柄处理 6 h 时的表达量最高,叶片处理 1 h 时的表达量最高。说明菜心 BclUBE2 基因在响应低温胁迫中发挥作用。