栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框(包括终止密码子),编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高(GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159),并在DE3中高效表达。     

大豆食心虫非典型气味受体基因克隆及发育期表达分析

非典型气味受体是昆虫嗅觉识别过程中重要的蛋白之一。本研究利用RT-PCR和巢式PCR的方法克隆了大豆食心虫非典型气味受体Olfactory co-receptor基因,命名为Lgly Orco,其编码区为1 419 bp,编码473个氨基酸,氨基酸序列中存在3个N位糖基化位点,分子量为53.5 k D,等电点为7.12,含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区,符合气味受体的典型结构特征。与鳞翅目已知昆虫的Orco同源性达到89%以上。不同发育期Lgly Orco表达量分析表明,Lgly Orco在二龄和三龄幼虫中的表达量是一龄幼虫的4~5倍,在四龄和五龄幼虫中的表达量是一龄幼虫的70%和50%,而在雌性成虫中的表达量是雄性成虫中的11倍。本研究将为大豆食心虫的嗅觉识别系统和大豆食心虫防治技术研究提供理论依据。     

大豆GmGBP1基因的原核表达及重组蛋白纯化

将大豆中已克隆的一个新的SKIP基因(GmGBP1)构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,对其进行IPTG诱导.结果表明:在IPTG浓度为0.1 mmol·L-1,诱导时间为8h,诱导温度为37℃时,重组蛋白得到表达,分子量大约为95 kDa,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,用8 mol·L-1尿素对其进行溶解后经GST柱纯化,得到较好的纯化效果.     

大豆GmERF6基因的原核表达及重组蛋白纯化

将大豆中已克隆的一个新的ERF转录因子基因(GmERF6)构建到原核表达载体pET28上,导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行IPTG诱导.结果表明:在IPTG浓度为0.3 mol·L-1,诱导时间为3h时,重组蛋白得到表达,分子量大约为30 kDa.SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在...     

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

大豆GmAAP 基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

本研究以大豆Williams 82为实验材料,采用RT-PCR技术克隆到了GmAAP 基因,其开放阅读框长度为1440 bp,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,GmAAP蛋白分子量为53.286 kD,理论等电点为8.93,不稳定指数为34.04,属于稳定的蛋白结构;其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲分别占据47.18%、15.66%、2.71%、34.45%;跨膜区与疏水性分析显示其含有10个跨膜区,且构成跨膜区的氨基酸多为疏水性氨基酸;GmAAP与野生大豆AAP6亲缘关系最为相近,且序列比对的一致性为100%,可能为大豆AAP6 基因。构建融合表达载体,利用PEG-Ca2+介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,结果显示GmAAP定位在质膜上。AAP能提高豆科植物对外源氮的吸收与利用率,进而增加种子内贮藏蛋白含量,提升大豆品质。本研究的结果可为GmAAP 功能 的进一步研究奠定基础,同时也为氮素的高效利用提供候选基因。     

野生大豆与栽培大豆杂交后代不同品种(系)的光合特性比较与聚类分析

为发现高光效亲本,以野生大豆及其与栽培大豆的杂交后代品种(系)为研究对象,研究其在田间条件下的光合特性,以评价杂交品系的育种潜力。所有试验材料于2017年同时种植于通辽市查金台牧场,小区种植,随机排列,土壤条件、环境条件和管理条件一致。在自然条件下测定15个材料的光合参数,并对其进行单因素方差分析、相关分析、主成分分析、聚类分析以及判别分析。结果表明,所有杂交后代及野生大豆光合参数都表现出显著差异。净光合速率与羧化效率、水分利用效率及蒸腾速率极显著正相关,与胞间CO2浓度和SPAD极显著负相关。筛选出5个划分光合能力的参数,分别为净光合效率(Pn)、羧化效率(CE)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和水分利用效率(WUE)。以5个光合参数对野生大豆及其与栽培大豆杂交后代品种(品系)进行聚类分析,可将其分为3类,并建立3个判别能力高的判别模型。通过对光合特性的评价,选出10个光合特性较好品种(品系),包括600、9010、9004、0004、9006、0005、9002、9008、内农S002饲用大豆和9014,具有高净光合速率、低胞间CO2浓度、较高蒸腾速率、高羧化效率等特点。这些品种(品系)在产量及生物量表现也较好。     

栽培大豆和野生大豆及其回交后代苗期耐盐性分析

以逐代人工耐盐性筛选的栽培和野生大豆杂交组合( Lee68×N23227)F5代株系3060为父本,以耐盐栽培大豆Lee68品种为母本或轮回亲本,配置回交组合(Lee68×3060,编号C)得到的不同单株后代株系(BC1F2)为试验材料,采用苗期耐盐系数、相对生长速率、干物质积累量等指标,对它们的耐盐性进行了分析和评价...     

野生大豆与栽培大豆荧光特性比较研究

为了探讨野生大豆与栽培大豆荧光特性的差异,应用调制式荧光仪PAM2000分别测定了野生大豆、栽培大豆叶片、荚皮的荧光参数,并作比较.结果表明:野生大豆叶片、荚皮的最大光化学效率Fv/Fm、Fv/Fo比栽培大豆小;光化学猝灭系数qP随着光强度的增加逐渐减小,野生大豆叶片、荚皮的qP比栽培大豆小;非光化学猝灭系数qN随光强的增强,逐渐升高,野生大豆叶片、荚皮的gN大于栽培大豆;实际光化学效率ΦPSⅡ随着光照强度的增加逐渐降低,野生大豆叶片、荚皮的ΦPS Ⅱ小于栽培大豆;表观光合电子传递效率ETR随着光照强度的增加逐渐增加,野生大豆叶片、荚皮的ETR小于栽培大豆.     

野生大豆、半野生大豆和栽培大豆对苗期干旱胁迫的生理反应

以野生、半野生和栽培大豆为材料,在旱棚盆栽条件下进行苗期干旱胁迫试验.对叶绿素含量、光合速率、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、相对电导率、可溶性糖(WSS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶( CAT)活性进行测定.结果表明,在干旱胁迫下,叶绿素含量、光合速率、可溶性糖含量、脯氨酸含量及SOD活性表现为野生大豆＞半野生大豆＞栽培大豆;而丙二醛含量、相对电导率、POD活性则表现为野生大豆＜半野生大豆＜栽培大豆.干旱胁迫下不同类型材料各生理指标与正常供水条件相比都发生不同程度的变化,叶绿素含量、光合速率降幅为野生大豆＜半野生大豆＜栽培大豆;脯氨酸含量增幅为野生大豆＞半野生大豆＞栽培大豆;而丙二醛(MDA)含量、相对电导率、SOD活性、POD活性,CAT活性增幅变化顺序为野生大豆＜半野生大豆＜栽培大豆.在干旱胁迫下,野生大豆、半野生大豆和栽培大豆的生理指标发生显著变化,3种类型大豆的变化幅度差异显著.野生大豆在干旱胁迫下生理指标的表现优于半野生大豆和栽培大豆.     

NaCl胁迫对野生及栽培大豆渗透调节物质含量的影响

采用沙培试验对NaCl胁迫条件下野生及栽培大豆叶片中可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白质含量以及地上部及根部Na+、K+含量进行了测定.结果表明:0～200 mmol·L-1浓度范围内,随着NaCl胁迫浓度的增加,野生大豆叶片可溶性糖、脯氨酸含量均逐渐增加,可溶性蛋白含量先升高后降低;栽培大豆脯氨酸含量逐渐升高,可溶性糖及蛋...