龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

大豆胞囊线虫热激蛋白基因Hsp70的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术结合基因组步移技术,从大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)中克隆了热激蛋白70基因(Hsp70)的全长cDNA序列(Hg-Hsp-70),全长1 953 bp,GenBank登录号为FJ816100.1。碱基序列分析结果表明,该序列含有9个外显子与8个内含子,与其它线虫具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明,该基因编码650个氨基酸,相对分子量为70.7 kD,具有2个Hsp70基因家族的签名序列,与其它线虫的该基因氨基酸序列具有很高的同源性。构建了原核表达载体Hsp70pEASY-E1,采用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果表明,当IPTG终浓度为0.2～1.2 mmol.L-1时均能显著诱导表达;以终浓度0.8 mmol.L-1的IPTG诱导5 h蛋白表达量达到最大值。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

甜菜Actin基因片段的克隆及序列分析

根据其它植物Actin基因设计一对简并性引物,以甜菜根总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到pUCm-T载体上,阳性克隆经PCR鉴定测序。序列分析表明,克隆得到Actin基因家族的两个成员,其片段长度均为598 bp,编码198个氨基酸,它们间的同源性为87%。将其分别命名为BvACT1和BvACT2,已在GenBank中注册,登录号为KF214784和KF214785。多重序列比较表明,Bv A CT1氨基酸序列与其他植物Actin基因的同源性在92%以上,而Bv A CT2则在93%以上。     

花生(Arachis hypogaea L.) CaM基因克隆与序列分析

提取花生(Arachis hypogaea L.)幼嫩叶片基因组DNA,合成5'端和3'端引物,进行PCR并克隆测序,得到CaM基因组的2个异型基因PGCaM-1和PGCaM-3,登录Genebank并注册为AY517933、AY572856。序列分析表明,PGCaM-1序列全长1425 bp,在第25个氨基酸之后有一个长度为973 bp的内含子,PGCaM-3序列全长447 bp。两个异型基因的开放读码框均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸,同属于EF手型CaM超家族成员,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96%和98%,与已知花生CaM cDNA序列及氨基酸均有极高的同源性,序列之间的差异可能引起表达和功能上的差异。     

茶树根际土壤真菌ALF-1(Neurospora sp.)耐酸铝基因片段克隆

采用rt-PCR克隆了茶树根际土壤耐酸铝真菌ALF-1(Neurospora sp.)与耐酸铝相关的基因片段,该片段由ALF-1在酸铝诱导条件才表达。序列分析后获得359 bp的可读片段,最大开放阅读框为260 bp,位于第100-359 bp之间,编码86个氨基酸残基。BLAST分析结果表明,该片段与Arabidopsis thaliana (thale cress)的耐酸铝相关基因序列同源性为50%。     

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

柱花草编码CP12蛋白的cDNA克隆及其序列分析

叶绿体蛋白12(chloroplast protein 12,CP12)是一个存在于叶绿体与光合作用相关的蛋白。以亲本柱花草热研2号叶片为材料,根据豌豆CP12及柱花草响应低温的cDNASSH文库中CP12克隆片段设计引物,采用RT-PCR,从柱花草cDNA中克隆获得柱花草热研2号CP12基因全长序列,并在GenBank登陆(登录号:HQ906668),命名为SgCP12。柱花草热研2号CP12基因全长426bp,包含399 bp的ORF。通过生物信息学分析结果表明,CP12的C端具有高度保守的结构域。同源性分析表明,该基因与豌豆的CP12基因氨基酸序列同源性最高。     

荔枝果皮MADS-box基因的克隆与初步表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术从‘糯米糍’荔枝果皮中克隆到了1个1 208 bp的MADS-box基因，命名为LcMADS9。该基因包含1个738 bp的完整的开放阅读框, 编码245个氨基酸，具有典型的MADS-box基因结构，其编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有较高的一致性，其中与欧洲白桦（Betula pendula）的同源性高达80％。系统发育树分析结果表明，LcMADS9基因属于MADS-box基因家族中AP1/SQUA-like亚家族。实时荧光定量PCR分析结果表明，该基因在叶片、果皮和花中均有表达，而在根、茎和果肉中几乎没有表达。     

基于叶绿体rbcL和trnH-psbA序列的湖南茶树资源遗传多样性与亲缘关系研究

DNA序列分析在物种进化、亲缘关系、遗传多样性研究中得到了广泛应用。采用筛选的叶绿体rbc L序列和trn H-psb A序列对湖南新收集的26份茶树种质资源进行亲缘关系和遗传多样性分析。结果表明:扩增的序列在去除边缘不准确的部分后,分别获得了582 bp(rbc L)和426 bp(trn H-psb A)的片段序列,rbc L序列的变异位点共27个,占扩增位点数的5.15%,trn H-psb A序列的变异位点共134个,占扩增总位点数的31.46%。rbc L序列在26个参试材料中共产生17个单倍型,Hd和π分别为0.961和0.008 32,trn H-psb A序列共产生26个单倍型,Hd和π分别为0.998和0.046 79,收集的茶树资源具有较高的遗传多样性。采用MEGA 6.0软件按照UPGMA法分别对rbc L序列和trn H-psb A序列构建了分子系统树,各序列对参试材料的聚类结果有一定差异,rbc L序列和trn H-psb A序列在自展数值大于50%情况下分别将参试材料分为了3个类群和4个类群。参试资源除部分江华苦茶由于亲缘关系较近而聚在一起外,大部分资源都单独形成1个分支,彼此间亲缘关系较远。     

大豆线粒体细胞色素b基因的克隆及系统分析

根据实验室测序的大豆线粒体基因组片段设计线粒体细胞色素b(Cytochrome,cob)基因特异引物,PCR扩增获得1173 bp大豆(JLGM-1B)线粒体cob基因保守区序列.经序列分析,该基因编码391个氨基酸,A+T含量58.1％,G+C含量41.9％.Southern杂交表明cob基因在栽培大豆线粒体基因组中...     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

小麦PM H+ ATPase基因克隆及其推定的蛋白结构分析

为了解小麦PM H~+-ATPase的基因全序列及其相关生物信息学特征,以豫麦18的基因组DNA为材料,用Full-Tail-PCR方法首次克隆到了小麦PM H~+-ATPase基因的启动子,并用分段克隆方法克隆了其全长序列(登录号:AY829002).DNA序列分析结果表明,该基因全长5 770 bp,含有15个外显子和14个内含子,其中第一个内含子片段较大,长达1 432 bp.碱基组分分析结果表明,该基因的启动子及5′UTR全长分别为161和201 bp,G+C含量分别高达72.1%和72.6%.对其生物信息学特征分析结果表明,该蛋白由951个氨基酸组成,分子量为104.6 kD,有44个功能位点,10个跨膜区,1个Cation-ATPase结构域,1个E1-E2-ATPase结构域和1个水解酶结构域.与其他植物序列比对分析结果表明,不同植物来源PM H~+-ATPase具有较高的保守性.该基因结构及其推定产物结构的复杂性说明该基因在生命活动调节中的精确性.     

芒果炭疽病菌环境pH信号调控基因PalF的克隆与分析

通过本地查找胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)橡胶菌株全基因组测序数据,获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因,获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现,该片段含有完整的开放式阅读框,与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列,序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp,其中含有1个大小为59 bp的内含子,推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域,推测该基因参与环境pH感应信号转导途径(Ambient pH-sensing signal transduetion pathway)的调控,为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。     

大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

甘蓝型油菜裂角相关基因BnRPL的克隆与分析

为鉴定甘蓝型油菜裂角相关基因，基于候选基因途径，利用同源克隆结合RACE方法，在甘蓝型油菜易裂角品系R2中扩增出了两个RPL基因的全长cDNA序列，其中一条序列长度为2 068bp，开放阅读框序列位置为154-1 911位，总长为1 758bp，命名为BnRPL.a。另一条序列全长为2 041bp，开放阅读框序列位置为154-1 887位，总长为1 734bp，命名为BnRPL.c。分析表明利用PCR方法得到的BnRPL基因由3个内含子和4个外显子组成，与拟南芥RPL基因结构相似。氨基酸序列同源性分析表明，BnRPL与拟南芥AtRPL和荒野独行菜（Lepidium campestre）的RPL具有较高的同源性。系统发育进化树显示RPL蛋白在双子叶植物和单子叶植物的分化过程中发生了序列变异。BnRPL基因存在时空表达的组织特异性，在发育的角果表达量最大；成熟后期在角果皮和假隔膜中表达，在种子中不表达。